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pH值敏感相分离特性蛋白质酶解试剂研究 　　摘 要 通过DEC/NHS偶联反应将胰蛋白酶（Trypsin）连接到具有pH值敏感性的壳聚糖（CS）链上。??Trypsin-CS偶联物保留了CS的pH值敏感相分离特性及Trypsin的酶催化活性??。浊度滴定实验表明，此偶联物的临界相分离pH值（CPSP）仍保持在偏中性范围内，并且随CS的分子量降低而略有上升。这种偏中性的CPSP值有利于相分离循环过程中保持酶的催化活性。分子量为8×10??4的CS与Trypsin的偶联物在存放30 d后可保留69%的初始酶活性。偶联物经过6次循环使用后的残余活性为初始活性的79%。Trypsin-CS偶联物可在低于CPSP值的条件下对蛋白质进行均相酶解，并在高于CPSP值时从催化体系中分离出来。HPLC肽谱分析表明，Trypsin-CS偶联物中Trypsin的自降解被显著抑制，因而有效消除了Trypsin自降解肽段对肽谱分析的干扰。 　　关键词 pH值敏感高分子；胰蛋白酶; 偶联; 酶活性; 肽谱分析 　　 　　1 引 言 　　pH值敏感高分子材料或凝胶是一种能随pH值的变化而产生体积或形态改变的材料。这种变化是基于分子水平及大分子水平的刺激响应性，因而具有可重现特性。通常，具有pH值响应性的高分子材料中含有弱酸性或弱碱性基团。随着介质pH值的改变，这些基团发生可逆的电离及去电离过程，导致大分子链段间各种作用力的平衡状态发生变化，引起溶胀体积变化或溶解度的改变。对于溶解-沉淀可逆的高分子而言，通过调节环境pH值，可实现溶解与沉淀状态的相互转化。利用此特性，线型pH值敏感高分子可用于生物大分子的分离、酶的固定化和免疫分析的研究[1～4]。 　　pH值敏感高分子材料具有临界相分离pH值（Critical phase separation pH point, CPSP）。在此pH值附近，高分子材料发生溶解及沉淀的两相转化。在生物分离与分析应用领域，接近于中性的CPSP值是该类高分子材料的理想特性。因为大多数生物分子在偏中性条件下能保持最大的活性。壳聚糖（CS）分子中氨基的p??K????a值在6.3～6.5之间[5],因此， CS是具有偏中性CPSP值的天然高分子材料。此外， 其丰富的氨基使生物功能分子极易被偶联到CS分子链上，并使复合物同时具备pH值敏感的相分离特性及生物活性。利用复合物的溶解-沉淀可逆特性，可实现均相生物催化反应、选择性识别与结合，及异相分离[6]。然而胰蛋白酶（Trypsin）的最佳活性pH值在7.0～8.0之间，天然CS的CPSP值仍无法满足要求。本研究通过CS的分子量控制制备CPSP值更接近于中性的Trypsin-CS偶联物，在低于CPSP值下进行高效的均相酶解反应，在高于CPSPH值下将Trypsin-CS进行沉淀分离及重复使用，消除了Trypsin均相催化时自身酶解产生的肽段对目标蛋白肽谱分析的干扰。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　751-GW分光光度计（上海分析仪器厂）；Agilent 1100高效液相色谱（美国Agilent公司）；HY-2调速振荡器（江南仪器厂）；移液器（芬兰雷勃公司）；DKS-A型恒温水浴锅（杭州蓝天化验仪器厂）。 　　壳聚糖（CS， ??M????w 8.0×10????5??，脱乙酰度96%，浙江海洋生物化学有限公司）；经TPCK处理的胰蛋白酶（Trypsin-TPCK, Worthington公司），牛血清白蛋白（BSA，上海生物工程有限公司）；二硫苏糖醇（DTT，上海生物工程有限公司），??n??-苯甲酰-??D,L??-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐（BAPNA，Sigma-Aldrich公司）；三羟甲基甲胺（Tris）；2-（??N??-吗啉）乙磺酸（MES）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐 （EDC）；??N??-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为生化试剂。 三氟乙酸（TFA,化学纯）；乙腈（CAN,色谱纯）；实验用水为去离子水。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 不同分子量CS的制备方法[7] 将5 g CS溶解在150 mL 3%醋酸溶液中，逐滴加入??50 mL 6% H??2O??2溶液，在 　　40 ℃水浴降解。每隔数小时，取适量溶液，用10 mol/L NaOH沉淀，以水洗至中性后，用乙醇冲洗，真空干燥备用。不同降解时间的ＣS在0.1 mol/L乙酸和0.2 mol/L NaCl溶液中于25 ℃下测定特性粘度数（??η??），按下式计算CS的粘均分子量（??M??η??）: 　　?ИЕ牵?0.00181 M????0．93????η?И? 　　2.2.2 Trypsin-CS偶联物的制备方法 将10 mg CS溶解于5