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PI3KAkt信号通路在胃癌干细胞中表达及意义 　　【摘要】 目的：研究PI3K/Akt信号通路在胃癌干?胞中的表达及意义。方法：收集笔者所在医院普外科胃癌切除术患者胃癌组织标本，应用肿瘤球悬浮分选法从组织标本中分选出胃癌干细胞和普通肿瘤细胞。比较两组细胞中PI3K、Akt的蛋白及mRNA的表达情况。结果：RT-PCR检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的mRNA相对表达量分别为0.680±0.122和0.513±0.121，明显高于普通胃癌细胞组的0.235±0.086和0.205±0.069，差异有统计学意义（P0.05）；Western blot检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的蛋白相对表达量为0.771±0.206和0.601±0.182，明显高于普通胃癌细胞组的0.215±0.012和0.218±0.028，差异有统计学意义（P0.05）。结论：PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中存在高表达的现象，表明该通路极有可能参与了胃癌的发生发展。 　　【关键词】 胃癌； 干细胞； PI3K； Akt 　　doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.2.084 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）02-0154-02 　　胃癌属于普外科常见的恶性肿瘤，源于胃黏膜上皮细胞[1]。研究发现，肿瘤是一种信号通路疾病。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）是参与肿瘤发生发展的重要细胞信号通路，因此抑制该信号通路成为胃癌靶点治疗和预防转移和复发的关键[2-3]。但目前PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中的表达研究罕见报道。本研究通过收集胃癌切除术患者胃癌组织标本，应用肿瘤球悬浮分选法从组织标本中分选出胃癌干细胞和普通肿瘤细胞，比较两组细胞PI3K、Akt的蛋白及mRNA表达量，以期能够为胃癌的预防和治疗提供新的依据和策略，现报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　收集笔者所在医院普外科胃癌切除术患者胃癌组织标本40例。患者年龄为28～53岁，平均（39.5±6.1）岁，所有患者均为首次确诊，均未接受过放疗或化疗，无其他肿瘤病史，无内分泌疾病。CD44、PI3K、Akt抗体均购自美国Abcam公司。小鼠抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 　　1.2 试验方法 　　胃癌干细胞的原代培养、分化及鉴定：应用肿瘤球悬浮分选法分选组织标本中胃癌干细胞。具体方法为，先用常规方法对组织标本进行脱蜡水化，使用微波炉对组织进行抗原修复，将组织中的坏死组织和血管剔除干净，清洗标本（D-Hank’s液）。将组织标本剪碎，再将其消化（胰酶），终止消化后，在离心机中离心，弃上清，将细胞收集、重悬，在其中加入超微磁珠（CD44阳性包被），充分混匀后，将分离株安装于磁场之上，将分选获得的细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子及b27的干细胞培养基中。培养箱的参数设置为：37 ℃，5% CO2，饱和湿度。使用CD44+对胃癌干细胞进行标记，使用免疫荧光染色对胃癌干细胞进行鉴定，阳性表达即可以认为其为胃癌干细胞，染色结果为阴性表达则为普通胃癌细胞。 　　1.3 实时荧光定量PCR检测两组细胞PI3K、Akt基因的mRNA表达水平 　　两组细胞的总RNA使用Trizol法提取，内参对照为GAPDH，（PI3K、Akt及GAPDH引物均由苏州金唯智生物科技公司合成）。对总RNA进行逆转录和RT-PCR扩增，荧光定量PCR仪为美国ABI公司，7500型。选用20 μl为扩增体系，试验反应条件：95 ℃、5 min循环1次；95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，循环40次；以0.5 ℃从65 ℃逐渐递增至95 ℃。按照2-△△CT计算Notch1 mRNA的相对表达量，每组均设3个复孔，均进行3次重复试验。 　　1.4 Western blot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达 　　收集两组细胞，使用常规方法提取总蛋白，储存在-80 ℃冰箱中。取总蛋白样品进行SDS凝胶电泳，冰浴下以80 V电压转至PVDF膜，时间为1.5 h。PBST缓冲液洗膜3次后，封闭1.5 h。剪膜后加入一抗，4 ℃孵育过夜，兔抗人PI3K抗体、兔抗人Akt抗体的稀释比例均为1∶1000。第2天进行复温，使用PBST摇摆清洗3次后，加入二抗，室内温度条件下孵育60 min。条带结果用凝胶成像分析系统对其进行收集，量化分析用Image J软件进行处理。 　　1.5 统计学处理 　　用SPSS 17.0对数据进行分析处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，