PI3KAkt信号通路在胞内布鲁氏菌存活中作用.docVIP

PI3KAkt信号通路在胞内布鲁氏菌存活中作用 　　摘要： 为了检测对PI3K/Akt信号通路在巨噬细胞内布鲁氏菌存活的影响，将布鲁氏菌粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308分别侵染细胞，应用Western blot技术检测RB51和S2308和对巨噬细胞内p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表达的影响；用MTT法检测抑制剂LY294002（LY）对细胞活性的影响；通过菌落计算法，检测抑制剂LY对胞内菌RB51和S2308存活的影响。结果表明，粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308都可激活 PI3K/Akt信号通路，但粗糙型菌株RB51的激活程度显著弱于光滑型菌株S2308（P0.01）；抑制剂LY在小于或等于20 μmol/L浓度时不影响细胞活性；抑制剂LY（20 μmol/L）可显著抑制光滑型菌株S2308的存活，但不影响粗糙型菌株RB51的存活。本研究表明，PI3K/Akt信号通路在光滑型菌株存活中发挥重要作用。 　　关键词： PI3K/Akt信号通路；布鲁氏菌RB51和S2308；胞内存活 　　中图分类号： S855.99 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0036-04 　　布鲁氏菌病是一种严重危害人类和家畜健康的人兽共患传染病[1-2]。布鲁氏菌为革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌，其急性期的临床特点主要为恶寒、发热、关节和肌肉痛等；人感染布鲁氏菌后造成骨关节、神经系统、生殖系统和免疫系统等损害，慢性期主要症状为骨关节病及包括神经系统在内的多系统多器官的损害，患者一般会表现出神经-精神症状，病程较长，容易复发并再感染，从而导致劳动力的丧失。动物布鲁氏菌病的特点是生殖器官、胎膜及其他多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、睾丸炎及关节炎等症状。布鲁氏菌病给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重危害[3]。因此，研究布鲁氏菌及其对宿主细胞的致病机制，为布鲁氏菌疫苗研发和防控提供理论依据，对于国民经济的发展和社会的安全具有重大的意义。 　　PI3K/Akt信号转导通路是重要的细胞生存通路之一，Akt作为PI3K/Akt信号转导通路的关键分子，在促进细胞生存、生长、增殖，促进细胞运动、侵袭和转移，抑制细胞凋亡方面起核心作用[4]。PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤组织有Akt的过度表达和活化。PI3K/Akt 信号通路还与一些病毒的生存繁殖密切相关，然而，PI3K/Akt信号通路与布鲁氏菌的生存关系如何，目前尚无相关报道，本研究推测PI3K/Akt信号通路在布鲁氏菌致病过程中发挥重要作用，因此，研究PI3K/Akt信号通路在布鲁氏菌致病过程中的作用，有助于揭示布鲁氏菌的致病机制，为抗布鲁氏菌药物的研制提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株、细胞与质粒 牛种布鲁氏菌参考株2308和牛种布鲁氏菌疫苗株RB51，由石河子大学人畜共患病实验室提供；大肠杆菌DH5α，由铜仁学院生物与农林工程学院细胞生物学实验室保存。 　　1.1.2 主要试剂 无内毒素质粒大提试剂盒、增强型 HRP-DAB 试剂盒，购自天根生化（北京）科技有限公司；胎牛血清购自GIBCO公司；细胞转染试剂LipofectamineTM2000，购自Invitrogen公司；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）、NaCl，购自Oxoid公司；琼脂糖购自上海生物工程技术有限公司。MTT、DMSO，且以DMSO作为溶剂，购自索莱宝公司；LY 购自碧云天公司；兔抗鼠磷酸化Akt（Ser473）和Akt（Thr308）、Akt单克隆抗体和HRP―羊抗兔二抗，购自Cell Signaling Technology公司；β-actin购自bioworld公司；ECL荧光检测试剂盒购自Thermo公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自上海生物工程技术有限公司。 　　1.2.3 布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7 将16M用PBS洗脱菌体，利用细菌比浊法计算数量，按比例通过10倍稀释菌悬液，然后将悬液涂于固体培养基上，置于37 ℃、10% CO2培养箱中培养3 d，每个稀释浓度重复3次，进行计数取平均值确定布鲁氏菌数目。以50 ∶ 1（细菌个数 ∶ 细胞个数）的比例，用16M侵染RAW264.7细胞，并将侵染后的RAW264.7细胞置于37 ℃ 5% CO2培养箱中继续培养。 　　1.2.4 细胞蛋白质提取 细胞计数并收集1×106个细胞，1 500 r/min 离心5 min弃上清收集细胞。加入1×PBS洗涤3次弃上清。细胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液。加入PMSF （100 mmol/L）10 μL/mL、 Na3V