ELISA方法在献血者血液检测中应用及注意事项.docVIP

ELISA方法在献血者血液检测中应用及注意事项 　　【中图分类号】R446.1 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2017）10--01 　　血液质量是当前输血管理工作中一项重要课题。为了保证血液质量，确保临床输血安全有效，遏制经血传播疾病的发生，卫生主管部门规定各采供血机构，应分别对献血者采用ELISA法进行HBs―Ag、抗一HCV、抗一HIV、TP等各项指标的检测，并制定了各种质量标准、操作规程和技术规范。 　　酶联免疫吸附试验（ELISA）具有敏感性高、特异性强、操作简便等优点，是目前采供血机构对献血者血液标本进行安全性指标检测主要的方法。近年来，各种自动化检测仪器设备在血站检验科得到了普遍应用，人员素质及检测试剂质量不断提高，检验质量得到了充分保证。但仍有一些困扰实验室人员的问题需要注意及解决，现探讨如下。 　　1 ELISA的基本原理 　　ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术，几乎所有的可溶性抗原一抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平。该方法的基本原理如下：（1）将抗原或抗体结合到某种固相载体（目前以聚苯乙烯微量滴定板最为常用）表面，并保持其免疫活性。此步骤称为“固相载体的包被”，在商品化试剂盒中均已完成。（2）再将抗原或抗体与某种酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）连接成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。检测时，按相应顺序加入待检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体，使其与固相载体上的抗原或抗体发生反应。以洗涤的方法洗去各步骤中过量的未结合物质，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（3）最后加入酶反应的底物，底物即被酶催化生成有色产物，而有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定量分析。此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 　　2 ELISA的分类 　　ELISA方法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据样本中待测物质的种类及性质不同，可以设计出各种不同类型的检测方法。临床检验工作中用到的ELISA方法主要分为以下几种类型：（1）用于检测抗原的：双抗体夹心法和竞争法；（2）用于检测抗体的：双抗原夹心法、间接法、竞争法及捕获包被法等。 　　3 ELISA检测的操作要点 　　在ELISA操作中有以下几个步骤较为关键：（1）加样：加样要准确，试剂应垂直滴加，不得倾斜、人为的加大试剂量。使用一次性吸头，防止交叉污染。定期校准加样器。标本应加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要溅出及产生气泡。（2）温育：96孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围孔与内部孔的升降温速率不同，造成周边与内部孔结果有差异。因此，温育过程中应该用封板膜封闭整块板，尽量避免边缘效应的产生。温箱温度必须严格控制，温育时间也应按说明书规定力求准确。（3）洗板：冼涤是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，??结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。洗涤时确认洗液注满每个板孔，但不可溢出板孔，弃液后将孔内液体在吸水纸上拍干。为了洗涤效果更好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次，或适当增加洗板的次数。（4）显色终止：显色时间应严格按说明书的规定。应在显色终止15min内进行酶标仪读取。 　　4 ELISA检测中常见问题 　　4.1 ELISA测定中存在的“灰区”问题 　　ELISA是一种定性试验，必须在“阳性”与“阴性”之间有一条明确的分界线，也就是所谓的“阳性判断值”（Cutoff），样本的吸光度值（A）大于等于Cutoff值就判读为阳性，否则则判读为阴性。然而在实际工作中经常会出现样本的吸光度值（A）低于但接近Cutoff值的情况，即ELISA检测中的“灰区”。对于这种情况，为输血安全考虑，常常将这些血液报废。在实际工作中可将“灰区”设在Cutoff值的70%，即对于样本的吸光度值（A）在Cutoff值的70%到阳性判断值之间的将其报废。通过灰区的设定，血液安全能得到更好的保障。 　　4.2 “钩状效应”（Hookeffect）问题 　　“钩状效应”系指在一步法ELISA中，测定显色随着待测标本中抗原或抗体浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原或抗体浓度的增加而开始下降直至不显色，而出现假阴性结果的问题。在血液筛查中，有可能因“钩状效应”的存在而出现假阴性的主要是HBsAg和抗HI