IBA浓度与培养基对黄芩不定根生物量和总黄酮含量影响.docVIP

IBA浓度与培养基对黄芩不定根生物量和总黄酮含量影响 　　摘要：为了筛选适宜黄芩不定根生长的培养基和IBA浓度，研究了2种培养基B5、MS以及不同浓度IBA对不定根生长和总黄酮积累的影响。结果表明，B5+1.0 mg/L IBA为最适培养基，此时黄芩不定根生长状态良好、健壮，生物量较多，并且总黄酮含量最高，达到2.49 mg/g，明显高于其他处理。 　　关键词：黄芩;不定根;IBA浓度;培养基;总黄酮 　　中图分类号：S567.23+9.043 文献标志码：A 　　文章编号：1002-1302（2015）04-0065-02 　　收稿日期：2014-05-23 　　基金项目：吉林省科技项目（编号：201115228）。 　　作者简介：田海丽（1990―），女，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事植物生物技术研究。E-mail：tianhaili123@。 　　通信作者：吴松权，博士，副教授，硕士生导师，主要从事植物种质研究。Tel：（0433）2435633;E-mail：arswsq@。 　　黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为唇形科黄芩属多年生草本植物，别称山茶根、黄金茶，始载于《神农本草经》，被列为中品[1]。黄芩以根入药，其味苦性寒，有清热除湿、泻火解毒、止血安胎、镇静抗炎的功效[2-3]。黄酮类化合物是黄芩的有效成分，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗HIV、清除自由基等作用，并且其毒性小，不易产生耐药性，生物安全性高[4-8]。这些特点使得黄芩的应用和开发越来越受到国内外医学界的关注，需求量随之急剧增加，致使野生黄芩被大量采挖，野生资源遭到了严重破坏，而黄芩在栽培过程中往往出现品质下降、农药残留等问题，市场供求矛盾日益尖锐。 　　不定根培养是一种植物器官培养方法，近年来正成为获取特定次生代谢产物的有效手段之一，具有生长周期短、可人为控制生长条件、重复性强等优点[9]。在目前的药用植物不定根研究中，研究得较为透彻的是人参，如韩国在研究人参不定根培养方面取得了重大成就，已达到了工业化生产程度;我国科研人员也相继对丹参、太子参、三七、红豆杉、甘草、柴胡、苍术、白术、东北刺人参、黄芪进行了研究[10]。但是目前还未发现利用黄芩不定根进行次生代谢的研究，因此本试验以黄芩为材料诱导不定根，研究B5、MS培养基与不同IBA浓度的组合对不定根增殖的影响，以期通过测定生物量、总黄酮含量，优化出最适宜的培养基与IBA激素浓度，为利用黄芩不定根规模化生产黄酮类化合物提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料和仪器 　　黄芩种子采集于吉林省延边朝鲜族自治州安图县。标准品芸香苷购自上海融禾医药科技发展有限公司;试验中所用到的其他试剂均为分析纯。 　　主要仪器为UV-3100紫外-可见分光光度计。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 黄芩不定根诱导 选取籽粒饱满的黄芩种子播种，待苗长至6 cm时，选取根部，先用自来水冲洗2 h，再分别用75%乙醇漂洗45 s、无菌水漂洗3次、0.1%氯化汞消毒 6 min、无菌水漂洗6次后切成1 cm×1 cm的外植体，接种于B5+2.0 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂、pH值为5.8的培养基上，于（25±1） ℃暗培养，诱导不定根。 　　1.2.2 培养基及激素浓度组合的筛选 培养基为MS、B5，添加不同浓度的IBA（0、1、2、3、4、5 mg/L），培养基中其他成分同诱导培养基。在（25±1） ℃条件下暗培养7周，60 ℃烘干后称其干质量，即为生物量。 　　1.2.3 总黄酮测定 （1）对照品溶液的制备：精确称取1 mg芸香苷标准品，置于10 mL容量瓶中，先加30%乙醇溶解，再定容至10 mL，混匀后配制成标准溶液。（2）标准曲线的绘制：精确量取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再分别加入 0.3 mL 5%亚硝酸钠，混匀，静置6 min;加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，静置6 min;加入2.0 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液，再分别用30%乙醇定容至10 mL，静置15 min，在 510 nm 波长处测定其吸光度D510 nm。以吸光度D510 nm为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，y=11.892 9x+0077 6，r2=0998 2。（3）样品溶液制备：称取100 mg烘干至恒质量的黄芩不定根，在液氮中充分研磨，加入1 mL无水乙醇充分混匀，振荡暗提取24 h，12 000 r/min离心10 min，收集上清液置于1 mL容量瓶备用。（4）样品总黄酮的测定：精确量取 0.3 mL 样品，