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CRISPRCas9系统及其在单子叶植物中应用 　　摘要：CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶，已经成为继锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease，简称ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，简称TALENs）之后的新型高效定点的基因组编辑新技术。作为新型的基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统拥有突变效率高、构建简单、花费成本低等特点，自其出现之后，受到广泛关注且得到迅速发展，给植物基因组研究和遗传育种带来革命性的变革。目前，该技术已经在多种单子叶植物中实现了基因组定点精确编辑，包括水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）等单子叶植物。 　　关键词：CRISPR/Cas9系统；基因编辑技术；单子叶植物；植物基因组；遗传育种 　　中图分类号： Q789 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0021-04 　　收稿日期：2016-04-24 　　基金项目：国家自然科学基金（编号：3137616）；山东省自然科学基金（编号：ZR2011CM044、ZR2011CM006）。 　　作者简介：徐继法（1987―），男，山东枣庄人，硕士，研究方向为植物分子发育生物学。E-mail：dongfengxjf@163.com。 　　通信作者：宋建成，博士，硕士生导师，研究方向为植物分子发育生物学。E-mail：jcsong88@。 基因组编辑技术是指将目的基因整合到宿主基因的特定靶位点上，从而达到特异性的改造生物基因组DNA，是基因功能研究的重要方法。基因组编辑技术通过构建人工核酸内切酶将基因组靶位点双链DNA片段特异性切割开断裂（double strand broken，简称DSB），继而使细胞内非同源末端连接（non-homologous end joining，简称NHEJ）和同源重组（homologous recombination，简称HR）这2种修复机制激活，断裂DNA片段得到修复，使该位点出现插入和缺失以及同源片段重组，此过程不仅可以使基因发生突变也可实现同源重组，可以说真正实现了对基因的编辑。目前，能对基因实现定点精确编辑的技术主要有锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFNs）[1-2]、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator like effector nucleases，简称TALENs）[3-4]、成簇的规律的间隔的短的回文重复序列和相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein，简称CRISPR/Cas9）[5-6]。 　　CRISPR/Cas9系统在应用方面与ZFNs、TALENs相比具有巨大的优势，载体构建操作简单，对每1个基因靶位点修饰只需合成1个靶标sgRNA，就能顺利实现对基因组精确定点编辑，而ZFNs、TALENs的编辑操作则相对繁琐复杂[7-8]；此外，CRISPR/Cas9系统还拥有试验周期短、成本花费低、易于推广等特点。2013年，CRISPR/Cas9系统作为一种新的突破性基因编辑技术出现，就得到迅速推广与应用。目前该系统在水稻、小麦、玉米、高粱等单子叶植物基因组中成功实现了精确定点编辑。 　　1 CRISPR/Cas9系统的基本结构 　　CRISPR/Cas9系统是细菌和古生菌在长期自然进化过程中针对噬菌体、病毒和外源DNA入侵进化形成的一种适应性免疫防御系统，其结构也是长期自然选择的进化结果。约40%的细菌和90%的古细菌都含有CRISPR/Cas9系统[9-10]。CRISPR/Cas9系统由CRISPR序列元件及其位点附近的一系列保守的相关Cas蛋白基因（CRISPR-associated genes，简称Cas genes）组成。CRISPR/Cas9的基因座结构相对简单（图1），主要由5′端的tracrRNA、Cas蛋白编码基因、CRISPR位点组成。不同物种间CRISPR位点数目与重复序列的数目也有所不同[11-13]，但均包括3种序列（重复-间隔序列、Cas蛋白序列、前导序列）。重复-间隔序列由多个相同的重?托蛄屑按┎迤浼涞募涓粜蛄凶槌桑?间隔序列可以特异性地识别外源DNA。 　　1.1 CRISPR/Cas9系统的3个主要类型 　　CRISPR/Cas9系统可分为3种不同的类型：TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ[14-15]。TypeⅠ系统是