RNAi抑制肝星状细胞TIMPI基因表达及对细胞生物学行为影响.docVIP

RNAi抑制肝星状细胞TIMPI基因表达及对细胞生物学行为影响 　　摘　要：研究了siRNA对大鼠肝星状细胞(CFSC)TIMP-I基因表达及对细胞生物学行为的影响，用RT-PCR方法获得带有T7启动子的TIMP-I全基因序列，体外转录法获得TIMP-1dsRNA，Diccr酶切后得到siRNA，用质脂体将siRNA转染至CFSC，RT-PCR检测TIMP-I mRNA的表达，MTT方法检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果成功获得TIMP-I siRNA，将TIMP-I siRNA转染至CP5C 12、24、48 h后，与对照相比，TIMP-I mRNA的表达逐渐下降，经OuanitY Onc(BIO-RAD，USA)分析后，其抑制率分别为49.18％、58.72％和64.73％；siRNA转染CFSC细胞后，CFSC生长受到抑制，细胞凋亡不明显，实验结果表明体外转录法得到的siRNA能有效地降低大鼠CFSC中TIMP-I的表达，明显抑制CFSC的增殖，但不直接引起CFSC的凋亡。 　　关键词：RNAi；基质金属蛋白酶组织抑制因子-1；肝星状细胞；细胞凋亡 　　中图分类号：R34　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0342-06 　　 　　基质金属蛋白酶组织抑制因子－1(TIMP-1)是近年发现的一种由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，可抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性的糖蛋白，其分子质量为20kD，由207个氨基酸组成，TIMP-1广泛存在于组织和体液中，但在正常肝组织中却很少表达，在发生肝纤维化时，肝组织中TIMP-I基因表达水平随着肝纤维化程度的加重而增加，当肝纤维化的逆转时其表达水平下降，可见了IMP-1对肝纤维化的维持起着重要的作用，目前抑制TIMP-I基因在肝纤维化组织中的表达已经成为抗肝纤维化研究热点之一，本研究采用RNAi技术，抑制了大鼠肝星状细胞中TIMP-I基因表达，并探讨TIMP-I基因表达受到抑制后对CFSC的增殖与凋亡影响，为肝纤维化的治疗提供新的治疗手段。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　主要材料 　　1．1．1　载体、细胞和菌株 pGEM-T载体购自Promega公司，肝星状细胞系(CFSC)由上海长征医院馈赠，E.coli JMl09购自TaKaRa公司。 　　1．1．2　主要试剂 　　RT-PCR kit、Trizol试剂为Invitrogen公司产品 ;RNAMaxx high yield transcription kit,Recombi-nant Dicer Enzyme kit，GeneEraser siRNA Transfe-ction Reagent kit均为Stratagene公司产品；AnnexinV，FITC细胞凋亡检测试剂盒为北京宝赛公司产品、四甲基偶氮唑(MTT)为Sigma公司产品。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　总RNA的提取及RT-PCR法获得TIMP-I目的基因 　　从-80℃冰箱中取8周大鼠冰冻肝组织(用本室已构建的大鼠肝纤维化模型)100mg，放入匀浆器中，按说明书用Trizol试剂提取总RNA，-20℃保存，Primer premier 5.0引物设计软件自行设计并由上海博亚生物技术有限公司合成两对PCR引物，序列如下(划线处为T7启动子部分)： 　　第一对引物 　　Sense primer: 5-CTFCCAGTAAAGCCTGTGG-3Antisense primer: 5-GGGAAGGCTICGGGTCAT-3 　　第二对引物 　　Sense prime: 5GCGTAATACGACTCACTATAGGC 　　TTCCAGTAAAGCCTGTAG-3 　　Antisense primer: 5-GCGTAATACGACTCACTATA 　　GGGGGAAGGCTTCGGGTCAT-3 　　参照Invitrogen二步法RT-PCR试剂盒说明书，以1μg总RNA为模板进行RT-PCR，循环参数为94℃2min，94℃30s，48℃30s，72℃50s，30个循环，72℃5 min。 　　1．2．2　pGEM-T/TIMP-1重组质粒的构建及鉴定 　　TIMP-I基因的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，在4℃下与pGEM-T载体过夜连接，取10μL连接产物转化JMl09感受态细胞，把转化产物涂布于含氨苄青霉素和IPTG与X-gal的平板上，放置于37℃孵箱中过夜培养，挑选白色单个菌落，经含氨苄青霉素的LB液体培养孵育12h后，取质粒DNA，进行PCR并用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送上海博亚公司测序。 　　1．2．3　PCR法获得带有T7启动子的TIM