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β―壳聚糖制备降解及胆固醇吸附活性研究 　　摘要：目的：制备β-壳聚糖、β-壳寡糖，并探究浓度对β-壳聚糖胆固醇吸附能力的影响。方法：使用鱿鱼骨制备β-壳聚糖，通过微波辅助过氧化氢法降解β-壳聚糖得到不同分子量的β-壳寡糖，并利用高效液相测定降解时间与所得壳寡糖分子量的关系，以纤维素为阳性对照，测定浓度对壳寡糖胆固醇吸附能力的影响。结论：利用鱿鱼骨制备得到了β-壳聚糖，并降解得到了低分子量的β-壳寡糖。通过实验得到结论，与纤维素相比β-壳寡糖对胆固醇具有较高吸附活性，且吸附能力与其浓度有关。 　　关键词：β-壳聚糖β-壳寡糖胆固醇吸附活性研究 　　一、概述 　　1.甲壳素和壳聚糖 　　甲壳素又名甲壳质、几丁质等，化学名β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，广泛存在于节肢动物的外壳及某些微生物的细胞壁中，是自然界存在的第二大天然有机化合物，仅次于纤维素。甲壳素经强碱处理，脱乙酰形成壳聚糖，壳聚糖的化学名为β-（1，4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，壳聚糖与纤维素有相似的结构，只是纤维素2位上是羟基，壳聚糖的是氨基。甲壳素与壳聚糖结构式如图1： 　　甲壳素与壳聚糖作为天然产物， 具有资源丰富、安全无毒、生物相溶性、生物可降解性、细胞亲和性、抗菌性等优点， 应用于诸多领域。但因其只溶于酸性介质，而不溶于水或一般有机溶剂，使其应用方面仍受到一定限制。 　　2.β-壳聚糖 　　随着海洋渔业发展，每年都有大量的鱿鱼骨由于其不可食用性而作为生产垃圾丢弃，这不仅浪费资源，也污染环境。鱿鱼骨是重要的海洋资源――β-壳聚糖的主要来源。β-壳聚糖具有不同于α-壳聚糖的平行结构，导致其在制备方法和实际应用上，也与α-壳聚糖有着明显差别。通常β-壳聚糖较α-壳聚糖具有相对弱的分子间作用力，因而溶解性、反应活性和对溶剂的亲和性更好。作为一种可再生的天然多糖材料，β-壳聚糖已经广泛应用于伤口缝合和软骨损伤等医药领域，能够促进细胞再生、防止疤痕形成。此外研究发现，β-壳聚糖具有更好的保水性和保湿性；同样条件下，β-甲壳素更易脱乙酰基。 　　当下肥胖日益普遍，并带来一系列健康问题，过多摄入胆固醇是肥胖的起因之一。而目前尚缺乏对β-壳寡糖后对胆固醇吸附能力的研究，通过实验研究可以为减肥药物的研发提供相关数据。 　　二、材料与方法 　　1.实验材料 　　鱿鱼骨（日本枪乌贼，Loligo Japonica）；1%的氢氧化钠溶液；4%的盐酸溶液； 　　过氧化氢；冰乙酸溶液；纤维素；胆固醇；氯化钠；油醇。 　　2.实验仪器 　　超声波微波组合反应系统（南京先欧仪器制造有限公司） 　　电子天平（Electronic Scale）；水浴锅（IKA HB10 digital） 　　立式压力蒸汽灭菌器（BOXUN）；超声波细胞粉粹机（宁波新芝科器研究所） 　　震荡培养箱ZQLY-180F（上海知楚仪器）；胆固醇试剂盒 　　高效液相色谱分析仪（Agilent Technologies） 　　3.处理方法 　　（1）制备β-壳聚糖 　　将鱿鱼骨表面的组织残留物清洗干净后烘干，称取20g鱿鱼骨置于一定浓度盐酸中室温下浸泡7h，洗净至中性后置于1%的氢氧化钠中90℃，水浴反应2h进行脱蛋白，洗净至中性烘干，即得β-甲壳素。称取5gβ-甲壳素，用40%的氢氧化钠95℃反应6-8 h脱乙酰基处理，即得β-壳聚糖。 　　（2）β-壳聚糖降解及分子量测定 　　称取12g自制β-壳聚糖，溶解于400 ml浓度为2%的冰乙酸溶液（v/v），搅拌溶解直至获得澄清、均质的β-壳聚糖。将50ml溶解后的β-壳聚糖倒入100ml微波反应器中，加入30%过氧化氢1.5-3mL，600W，70℃条件下500r/min，依次反应5 min、10 min、20 min。反应结束后，微波炉内放置冷却5～10 min，取出，加1mol/l氢氧化钠中和，抽滤除去不溶物。滤液用3～4倍量无水乙醇充分沉淀，抽滤取滤液。最后检验产品是否溶于水。 　　将降解后的β-壳寡糖透析，冷冻干燥得到粉末状壳寡糖样品，分别将反应5 min、10 min、20 min的样品进行高相液相色谱分析。 　　（3）胆固醇吸附活性研究 　　①配制胆固醇胶束（PH=7.4，15mmol/L） 　　②用超声波细胞粉碎机粉碎细胞。 　　③实验设置实验组和对照组，对照组分别是空白组和纤维素组，实验组有5组，分别加入10、20、40、60、80mg的β-壳寡糖（分子量约为5000）。所有组均加入5ml胆固醇胶束。 　　④用振荡培养箱恒温振荡（37℃）培养两个小时，离心上清液，用胆固醇试剂盒测胆固醇吸附率。 　　三、结果 　　1.制备β-壳聚糖成品（图2） 　　2.壳聚糖浓度与