β―紫罗兰酮与β―乳球蛋白相互作用光谱法研究.docVIP

β―紫罗兰酮与β―乳球蛋白相互作用光谱法研究 　　摘要：在pH=7.0，t=37℃条件下，采用荧光光谱和紫外可见-吸收光谱研究了β-紫罗兰酮与β-乳球蛋白的相互作用。研究的结果表明：这种相互作用使β-乳球蛋白发生内源荧光猝灭，其机制为静态猝灭。通过计算得到了两者的结合常数（k=0.605×103L/mol）和结合位点数（n=1）。 　　关键词： β-紫罗兰酮;β-乳球蛋白;荧光猝灭; 同步荧光谱; 紫外可见-吸收光谱; 　　引言 　　β-紫罗兰酮（β-ionone） 是一种芳香族化合物，结构（如图2）中含有一个芳香苯环，具有疏水性。它广泛存在于天然食物中，比如水果、蔬菜、谷物及牛奶中，在医药工业中还可以用于合成维生素A和β-胡萝卜素[4，5]，这与人们的生活息息相关。β-紫罗兰酮是一个单体，却表现出较强的抗癌作用[6，7]。研究蛋白质与β-紫罗兰酮的相互作用，可以为了解β-紫罗兰酮的生物活性机制提供重要线索。 　　1 实验部分 　　1.1 仪器和试剂 　　F-4600型荧光分光光度计（日本日立公司）;UV-1800型紫外可见分光光度计（上海Shimadzu公司）;UB-10标准型PH计（上海华耀贸易公司 ）;FA1604B型电子分析天平（北京赛多利斯有限公司）; 　　β-乳球蛋白和β-紫罗兰酮购买于美国Sigma公司;磷酸钠缓冲液所用试剂为国内生化公司购置的分析纯;所用水为超纯去离子水。 　　1.2 实验方法 　　准确称量β-紫罗兰酮并配置成浓度为1mmol/L的溶液，准确称量β-乳球蛋白并配置成5 mg/ml的溶液，其中使用的缓冲液均为磷酸钠缓冲液（pH=7.0），置于4 的冰箱中保存。 　　在10 ml比色管中依次加入pH=7.0的缓冲溶液、1.0mlβ-乳球蛋白溶液和一定量的β-紫罗兰酮溶液，然后在27 和37 水浴锅中充分培养30分钟后开始测试荧光光谱。 　　荧光光谱测量，激发光狭缝和发射光狭缝均为2.5nm。?仍捶⑸溆?光是以280nm作为激发光波长，记录300nm-400nm范围的发射光谱;同步荧光是固定激发波长与发射波长的间距 分别为15nm和60nm， 记录240-320nmm范围的荧光光谱。紫外可见-吸收光谱测量范围为200nm到340nm 。 　　2 实验结果与分析 　　2.1 β-紫罗兰酮对β-乳球蛋白的猝灭反应 　　β-LG蛋白分子中含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸，具有较强的内源荧光。固定β-LG溶液浓度为0.05mg/ml，在其中加入不同浓度的β-紫罗兰酮，结果发现，β-LG的荧光峰随着β-紫罗兰酮浓度的增加而规律性降低，同时β-乳球蛋白的最大发射峰位发生5nm左右的红移，如图3所示，表明β-LG蛋白分子的构象发生了一定的改变。 　　对于静态猝灭，结合常数和结合位点数可由结合常数表达式（2）推导求出[10 ]： 　　（2） 　　2.4β-乳球蛋白与β-紫罗兰酮之间的能量转移效率和结合距离 　　根据F?rster 非辐射能量转移理论[11]，可以求出小分子与蛋白质发光基团之间的距离。 　　能量转移效率E与供体-受体之间距离r及能量转移距离临界R0的关系为： 　　（6） 　　R0为能量转移效率为50%时对应的距离。 　　（7） 　　其中 为取向因子，可取受能体与供能体各向随机分布的平均值 ; 为介质的折射指数，一般取水和有机物折射指数的平均值1.336， 为供能体的光量子产率，通常取蛋白质色氨酸量子产率为0.118，J为供能体的荧光发射谱与受能体的吸收光谱的重叠积分，可表示为： 　　（8） 　　其中 为供能体在波长 处的荧光强度， 为受能体在波长 处的摩尔吸光系数。摩尔能量转移效率可以由下式决定： 　　（9） 　　式中F0为能量受体不存在时能量供体的荧光发射强度， F为能量供体和受体浓度为1：1时蛋白质的荧光强度 。 　　图5为供能体与受能体浓度为1：1时，供能体β-乳球蛋白的荧光发射光谱（a）与受能体β-紫罗兰酮的吸收光谱（b）的光谱重叠。将图中光谱重叠部分分割成极小的矩形面积求和，应用公式（8）算得重叠积分为 　　代入方程（7）得到临界距离为 。由式（9）计算得到能量转移效率为 。根据公式（6）可以算出β-紫罗兰酮与β-乳球蛋白荧光残基间的距离为 。该距离小于7nm，符合能量转移理论。 　　2.6 β-紫罗兰酮对β-乳球蛋白构象的影响 　　β-紫罗兰酮加入β-乳球蛋白溶液中，两者发生了结合猝灭反应的同时发射峰位红移，我们可将通过同步荧光和紫外可见-吸收光谱进一步研究β-紫罗兰酮对β-乳球蛋白构象的影响。 　　3 结论 　　以β-乳球蛋白为基体，通过荧光光谱和紫外可见-吸收光谱研究了β-紫罗兰酮与蛋白质的结合反应。β-紫罗兰酮进入蛋白质分