miR―148b对肝癌SMMC7721细胞衰老影响.docVIP

miR―148b对肝癌SMMC7721细胞衰老影响 　　[摘要] 目的 探讨miR-148b对肝癌SMMC7721细胞衰老的影响。 方法 分别使用50 nmol/L的miR-148b mimics（miR-148b）和negative control（miR-NC）转染肝癌SMMC7721细胞48 h后，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-148b表达的变化。通过β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老的变化，应用western blot检测P21表达的影响。 结果 与对照组相比，miR-148b能明显增加肝癌SMMC7721细胞中miR-148b的表达。50 nmol/L的 miR-148b转染SMMC7721细胞48 h后，细胞形态变得大而扁平，衰老细胞比例明显增加[（9.67±2.08）% vs （43.67±3.51）%，P0.01]。miR-148b使肝癌细胞P21蛋白的表达也明显增加。 结论 miR-148b可能通过影响P21的表达促进肝癌SMMC7721细胞的衰老，miR-148b有可能成为肝癌SMMC7721细胞生物治疗的新靶点。 　　[关键词] 肝癌；miR-148b；衰老；P21 　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）05-0025-04 　　microRNAs是一类长度为20～24 bp、具有基因调控功能的非编码小分子RNA，主要通过影响mRNA的稳定及翻译调控基因表达功能[1]。大量研究发现，microRNAs在细胞增殖、分化、凋亡、衰老等多种生物学过程中发挥重要的作用[2-4]。miR-148b在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤的生物学功能及预后密切相关。前期研究结果发现miR-148b在肝癌组织和细胞中低表达，与肝癌的增殖侵袭密切相关[5，6]，目前miR-148b对肝癌细胞衰老的影响机制尚不清楚。本研究在2013年10～12月将50 nmol/L的miR-148b的类似物转染肝癌SMMC7721细胞48 h后，观察对细胞衰老特性及衰老相关蛋白P21的影响，为探讨miR-148b作为肝癌治疗靶点提供基础依据。现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 一般材料 　　RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco BRL公司， 肝癌细胞系SMMC7721购自中国科学院上海细胞库。衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天生物有限公司。miR-148b mimics（miR-148b）和negative control（miR-NC）转染试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司。LipofectmanineTM2000及Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司。兔抗人P21和GAPDH一抗购自美国 Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶结合的二抗购自武汉博士德公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 常规细胞培养 肝癌SMMC7721细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、含5%CO2培育箱下常规培养。 　　1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR） 采用TaKaRa公司的试剂盒，miR-148b和内参U6的引物探针由广州瑞博公司设计合成。miR-148b：5’-AAGTTCTGTTATACACTCAGGC-3’，内参基因U6：5’-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3’。反应体系为 SYBRR Green qRT-PCR Mix（2×）10 μL，PCR Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，cDNA 1 μL。其反应条件：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s， 60℃ 30 s×40循环，仪器为ABI公司7500型Real-time PCR仪。ABI step-one附带qRT-PCR分析软件分析CT（cycle threshold）值。目的基因RNA的相对表达量=2-Δ Δ CT， Δ Δ CT=待测样本（CT目的基因-CT内参）-对照组（CT目的基因-CT内参）。 　　1.2.3 β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老 转染组和对照组细胞培养48 h后离心后重悬，以1×105个/孔接种于12孔培养板中，贴壁 24 h 后用细胞衰老检测试剂盒染色，在37℃孵育过夜，细胞质内出现均匀一致蓝色细颗粒表示β-半乳糖苷酶染色阳性，即细胞出现衰老改变。 　　1.2.4 Western blot检测P21蛋白的变化 各组细胞转染培养48 h后， 提取细胞蛋白。总蛋白提取方法参照