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SRAP分析体系优化及在枇杷种质资源研究上应用 　　摘要：以me7(5’-TGAGTCCAAACCGGTCC-3’)和em7(5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’)正反向引物组合对西班牙枇杷品种Javierin进行了SRAP分析体系的优化，结果表明，在25μL反应体系中，5种主要成分的适宜浓度或用量分别是：dNTPs 0.3 mmol/L，Mg2++2，5 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，引物0.3μmol/L，模板DNA 20 ng，优化的扩增程序为：94℃预变性5 min。94℃变性l min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min 30 s，5个循环；之后94℃变性1min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min 30 s，35个循环；最后72℃下延伸10 min。并将该优化的体系在来自中国、西班牙、日本、意大利和美国的46份枇杷种质资源上进行了SRAP扩增的初步应用，经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳均获得了清晰、重复性好的SRAP指纹图谱。 　　关键词：枇杷；种质资源；SRAP；体系优化 　　中图分类号：S667.3 文献标识码：A 　　文章编号：1009-9980(2008)03-348-05 　　 　　SRAP即序列相关扩增多态性(sequencerelatedampli6ed polymorphism)，它是由美国加州大学蔬菜作物系Li等于2001年提出来的一种新型的基于PCR的标记系统。它针对基因的外显子里GC含量丰富而启动子和内含子里AT含量丰富的特点来设计引物进行扩增，因不同个体中的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该方法具有操作简便、中等产量、高共显性、高重复性、易于进行条带分离与测序等优点。而且该类标记在基因组中分布较均匀。适合进行基因定位、克隆、遗传图谱构建及遗传多样性分析等研究。由于SRAP引物设计的特殊性，可检测基因的可读框区域，因而体现的是物种间基因的多态性。检测的结果更能反映物种的遗传多样性和亲缘关系。目前SRAP已成功应用于柿、柑橘、香蕉、桃等果树遗传多样性的研究。 　　我国有非常丰富的枇杷种质资源，有红肉和白肉品种、品系或优良单株共计300多个，与此同时，我国也从日本、西班牙和美国等国家引进了超过10个优良品种，本试验所选用的40多个品种来自国内外引进的主栽品种，具有广泛代表性。我们先对枇杷SRAP体系进行了优化，在获得了重复性和可靠性均良好的谱带后，对来自国内外的46份枇杷种质资源进行了SRAP分析，为枇杷种质资源的分类和育种提供依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　试验于2007年在华南农业大学园艺学院生物技术研究所进行，试材取自华南农业大学枇杷种质资源圃，46份种质来自6个国家(表1)，取1 a生枝条的嫩叶装入自封塑料袋，清洗叶背茸毛及杂质后用吸水纸吸干备用。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　DNA提取基因组DNA的提取参照杨向 　　 　　 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1　dNTPs浓度对SRAP扩增的影响 　　dNTPs是PCR反应中核苷酸的来源，其用量直接影响PCR扩增的产量，浓度过高会导致核苷酸的错误掺入，过低则会影响合成效率。从图1扩增结果可见，0.1～0.4 mmol/L浓度的dNTPs均可扩增出条带，但在0.1 mmol/L时扩增量不足，条带不甚清晰，当浓度大于0.2 mmol/L时扩增条带比较清晰稳定，并以0.3和0.4 mmol/L dNTPs扩增出的条带最为清晰，因此本试验确定0.3 mmol/L dNTPs为最佳浓度。 　　 　　2．2 Mg2+浓度对SRAP扩增的影响 　　Mg2+浓度是扩增成败的重要影响因素之一。tooDNA聚合酶需由Mg2~激活，同时Mg2+也影响模板与引物的解链温度及引物的退火程度，尤其对PCR反应的特异性及扩增片段产率的影响较大。Mg2+浓度在1.5～3.0 mmol/L时都有扩增产物，但在2.0～3.0mmol/L时扩增条带较为稳定和清晰(图1)。因此，本试验认为Mg2+浓度为2.0～3.0 mmol/L都可以满足SRAP扩增的需要，经3次重复最后确定Mg2+2.5mmol/L为最适浓度。 　　 　　2．3　Taq DNA聚合酶用量对SRAP扩增的影响 　　TOO酶用量是影响PCR反应的关键因子，酶的用量过大易产生非特异扩增产物：过小则降低扩增产物的合成效率，从而影响多态性的检出率和扩增结果的重复性。本试验中，Taq酶用量在0.8～1.4 U范围内都可以扩增出条带，0.8 U时扩增量不足，以1.0～1.4U Taq酶扩增的条带相对清晰，因此，确定1.0 U的Taq酶用量为适宜。 　　2．4　引物