中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记克隆序列分析及辅助育种应用张剑侠.docVIP

中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记的克隆、序列分析及辅助育种应用张剑侠 　　摘要：对中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1300进行了克隆、测序及序列分析，结果表明该标记实际长度是1 354bp，因此更名为OPS03-1354，其GenBank登录号为DQ350885。该标记序列与99条来自欧洲葡萄的EST有同源性。其中与1条来自赤霞珠叶片感染葡萄皮尔斯病病原菌后获得的EST同源性为82％，与2条来自赤霞珠果实在不同发育期获得的EST同源性分别为80％和85％。该序列与1条来自中国野生华东葡萄白河-35-1叶片接种霜霉病病原菌后获得的EST同源性为67％。该序列编码葡萄的一种假定蛋白。此外，应用该标记对中国野生葡萄与欧洲葡萄的种间杂交广西-1×京可晶Fl代339株、白河-35-1×佳利酿F2代207株进行了辅助选择。 　　关键词：中国野生葡萄；抗黑痘病基因；RAPD标记；克隆；序列分析；标记辅助育种 　　中图分类号：S663.1　文献标识码：A　文章编号：1009－9980(2009)04-456－05 　　 　　葡萄黑痘病[Elsinoe ampelina(de Bary)Shear]是葡萄上的一种重要真菌病害，通常危害葡萄的新梢、幼叶、花、果等，严重影响葡萄的生长及果实品质。在我国长江流域该病的危害较重，北方地区雨水较多的年份也能造成较大的经济损失。欧洲葡萄品质优良，但抗病性差，多数品种易感黑痘病；而中国野生葡萄是重要的抗病种质资源，Wang等对中国原产的野生葡萄13种108个株系抗黑痘病的鉴定结果表明，它们均表现抗黑痘病。因此，利用中国野生葡萄的抗病性与欧洲葡萄进行种间杂交是培育抗病品种的有效途径。但通过杂交获得的杂种幼苗种植需要大量的土地，且对杂种基因型的选择是依据其抗病表现型间接进行，需要大量的人力、资金和时间投入，育种周期长，效率低。分子标记技术为加快农作物育种提供了新方法，由于分子标记与目标性状的基因相连锁，因此利用分子标记可以对杂种的基因型进行直接选择，从而可以提高育种效率。目前，分子标记在果树上已有不少研究报道，而且一些标记已应用于辅助育种(Marker-assisted Breed-ing)。 　　 　　随机扩增多态性DNA(RAPD)技术具有快速、简便且不使用同位素等优点，因而在辅助育种方面得到广泛的应用。我们是在前期研究获得中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记POS03-1300的基础上，对该标记进行克隆与测序以获得序列全长，为将其转换成稳定性、专一性更强的SCAR标记提供DNA分子依据；通过对其序列进行生物信息学分析，旨在了解其可能具有的功能，为进一步的研究奠定基础。此外，结合对种间杂种抗黑痘病的田间鉴定结果,应用该标记对杂种幼苗进行辅助选择，以加快育种进程。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　材料为西北农林科技大学葡萄种质资源圃中保存的种间杂交亲本及其后代：广西一1(抗病)×京可晶(感病)F1代339株(2,004年杂交)，白河-35-1(抗病)×佳利酿(感病)F2代207株(2002年由4个F1。代抗病单株6-12-1、6-12-2、6-12-4、6-12-6分别自交获得)。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1 葡萄基因组DNA的提取及RAPD反应体系葡萄基因组DNA提取方法及RAPD反应体系参照王跃进等的方法。Taq DNA聚合酶为洛阳华美生物公司产品，dNTPs、限制性内切酶EcoR I为TakaRa产品，随机引物、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒为上海生物工程公司产品，pGEM-T Easy Vector试剂盒为Promega产品，分子量标准Marker-12为东胜生物科技有限公司产品。 　　1.2.2　RAPD标记的回收　用前期研究获得中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1300的特异引物OPS03，分别对中国野生华东葡萄白河－35-1和欧洲葡萄佳利酿的基因组DNA进行RAPD扩增，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶上切取白河－35-1抗黑痘病基因的RAPD标记(DNA片段)，参照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明进行回收。 　　1.2.3　RAPD标记的克隆、测序　克隆方法参照文献[14]，测序由上海生物工程公司完成。 　　1.2.4　RAPD标记序列的生物信息学分析　登录NCBI (http：///)，利用Blastn和Blastx工具，分别对获得的抗黑痘病基因RAPD标记序列进行同源性比对。利用NCBI数据库的ORFFinder功能，对RAPD标记序列进行开放阅读框架分析。 　　1.2.5　RAPD标记辅助选择　应用特异引物OPS03对杂种后