P27_27kip1_、SKP2和CDX2在结肠癌中的表达及临床意义.pdfVIP

温州医学院硕t学位论文 材料与方法 一， 实验材料 1．主要试剂和器材 丹麦DAKO公司 鼠抗人P27¨P1单克隆抗体(克隆号SX53(38) 鼠抗人SKP2单克隆浓缩抗体(克隆号2C8D9)美国ZYMED公司 上海长岛生物技术有限公司 鼠抗人CDX2单克隆抗体(克隆号AMT28) CDX2mRNA探针及试剂盒 武汉博士得生物有限公司 PBS缓冲液 上海长岛生物技术有限公司 30％双氧水 上海长岛生物技术有限公司 多聚螯和物 上海长岛生物技术有限公司 DAB显色剂 上海长岛生物技术有限公司 苏木素 上海国药集团化学试剂公司 伊红．Y 上海国药集团化学试剂公司 中性树胶 上海长岛生物技术有限公司 切片漂烘温控仪 安徽电子科学研究所 医用微波炉YwY78l 浙江临安爱迪仪器厂 电热恒温培养箱 浙江嘉兴创字电器公司 脱水机 德国莱卡公司 普通莱卡切片机 德国莱卡公司 全自动染色封片机 德国莱卡公司 数字显示移液器 上海长岛生物技术有限公司 2、标本来源 60例结肠癌来自2004年1月-2005年12月浙江省余姚市人民医院根治手术 标本，术前均未经放射治疗和化学药物治疗。每一病例选取肿瘤及切缘各一个蜡 块，结肠癌中男40例，女20例，年龄20～87岁，中位年龄5l岁，高中分化 23例，低分化37例。累及浆膜者35例，伴淋巴结转移者42例，根据结肠癌 Dukes分期标准：A、B期17例，C、D期43例。 二，实验方法 1、免疫组织化学染色 1．1方法 每例组织分别进行P27¨pl、SKP2和CDX2蛋白三种标记，每例标本 均经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4Ⅱm，常规HE染色。 免疫组化采用EnVision两步法，按照常规操作。石蜡切片的抗原修复采用PH6．0 10mmol／L柠檬酸抗原修复液，高压锅加帽出气3min，快速冷却；滴加一抗(抗体 稀释比l：50)，40C过夜。阳性对照用已知阳性的乳腺癌或结肠黏膜切片，阴 温州医学院硕上学位论文 性对照用PBS代替一抗。 1．2 结果判断 阳性细胞为棕黄色颗粒位于细胞核或胞核伴胞质内，如只有胞质出现棕黄色 为非特异性染色。随机选取lO个高倍视野，计算每个高倍视野中阳性细胞数占 肿瘤上皮细胞总数的百分比，最后计算10个高倍视野的平均百分比，阳性细胞 百分比20％者为高表达(+)，20％为低表达(-)，高表达例数与各组病例总数 比为各组阳性表达率。 2、原位杂交 2．1方法 (1)切片脱蜡；二甲苯10分钟x3。 (2)水化：100％乙醇一95％乙醇一85％乙醇，各2分钟。 (3)水洗5秒×1次。 (4)PBS洗5秒×2次。 (5)0．IN的HCL处理，室温lO分钟。 (6)PBS洗5秒×2次。 (7)O．3％H202(PBS稀释)室温30．60分钟。 (8)PBS洗5秒×2次。 (9)擦干后滴加PK(10-100p g／ml，PBS稀释)，37C，30分钟·