TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测SIV2fSHIV病毒RNA拷贝数方法的建立及应用.pdfVIP

病毒RNA拷贝数方法的建立 第一节引言 荧光定量PCR(real．timePCR)技术是近年来发展起来的一项新技 术，已广泛应用于各种病原体的检测。它不仅可以对所检测的目的序列 进行定性分析，而且可以对其准确定量，能够对整个PCR过程进行实时 监控，具有常规PCR技术不可比拟的优点。与常规PCR技术相比具有 相对较高的特异性和灵敏度；扩增以后无需电泳，可以有效解决PCR产 物和溴化乙啶的污染；重复性好；自动化程度高等优点。国外已有运用 Green 们实验室也已经成功建立SYBR I染料的实时荧光定量RT-PCR方 法对SIV及SHIV的病毒载量进行检测，并与法国巴黎第五大学卢威教 授实验室使用的PCR-ELISA方法进行了参比，证实了该方法的可行性， 但鉴于目前国际上对TaqMan探针检测方法的普遍认同及好评，因此我 Green 实验室现有SYBR I方法的优缺点，来找到更适合我们实验室现有 条件的检测方法，为进一步的研究提供可靠的技术平台。 第二节材料与方法 实验材料： 1．RS外标准品 2．引物及探针 3．试剂盒 4．主要试剂及试剂的配制 5．仪器设备 6．耗材 1．RS外标准品 Green RS外标准品‘71是我们实验室自建的，用于SYBRI实时荧光定 外标准品。它首先利用巢式RT-PCR扩增SIVmac25 1病毒RNAgag基因 T载 该质粒再经限制性内切酶Not，酶 体上，构建pGEM-SIVga9477质粒， 切后，利用pGEM．T载体上携带的SP6启动子进行体外转录，转录出的 Green 品纯度高，应用SYBR I荧光定量RT-PCR方法可精确定量到 L。 100copies／U 2．引物及探针 本部分实验所用到的引物及探针见表1。 表l引物和TaqMan探针 Tab．1Primersand usedinthe probe experiment． 引物名称 位置 序列(5’一3’) PCR产物大小 Primers Site Sequence SIze 2F(NestedPCR、 GCAGAGACATCTAGTGGTGG 1360一1389 RT-PCR上游内引物) AAACAGGAAC 477bp 2R(NestedPCR、 1808．1837 RT-PCR GTTTTGTrG F游内引物) a (Real—time 1697一1720 RT-PCR上游引物) GTAC 9】bp b (Real—time CAArrllACCCAGGCATTT气A 1764．1788 RT-PCR下游引物)