IL-10基因启动子区G-1082A、C-592A多态性与IgA肾病相关性研究.pdfVIP

温州医学院硕士学位论文 材料和方法 一、对象研究 病例组选择1999年10月至2006年10月就诊于温州医学院附属第一医院 肾内科门诊和住院病人，经肾穿刺活检组织检查确诊为IgA肾病，并排除狼 疮性肾炎、紫癜性肾炎、慢性肝炎等继发性IgAN，共180例，平均年龄为36．5 ±9．8岁。对照组选择温州医学院附属第一医院健康体检志愿者，共163例， 平均年龄为38．7±9．1岁。IgA肾病病理改变按Hass分级标准进行分级。 二、主要材料与试剂 l、仪器及设备 PCR PCR扩增仪(GeneAmpSystem9600，PERKINELMER) 台式高速离心机(TGL16G) 水浴箱(HHI数显恒温水浴箱) 琼脂糖凝胶电泳仪(北京市八一器厂分析仪器厂) 微波炉(三菱公司) 一20C低温冰箱(西门子设备有限公司) 一4C低温冰箱(西门子设备有限公司) 微量进样器(德国eppendorf公司) DSHK一4型磁力搅拌器 紫外分光仪 2、试剂 (1)DNA大量制备纯化试剂盒(DNAIsolaationKit，Gentra systems Company) 主要成分 ①红细胞裂解液(RBC LysisSolution，含氯化铵、乙烯二胺基四 乙酸、碳酸氢钠)：裂解红细胞 ②细胞裂解液(cellLysis Solution，含三羟甲基氨基甲烷、乙烯 二胺基四乙酸、十二烷基硫酸钠)：裂解有核细胞 ③蛋白沉淀液(protein solution，含醋酸铵)： precipitation 使蛋白质成团 ④DNA水合液(DNAhydrationsolution，含三羟甲基氨基甲烷、 乙烯二胺基四乙酸)：使DNA与水合液起水合作用而易于保存 (2)TE缓冲液：lOmol／LTris-C1、lmmol／LEDTA (3)0．5XTBE电泳缓冲液：0．045mol／L Tris碱、0．045mol／L硼酸、 0．001mol／LEDTA 温州医学院硕士学位论文 (w／v)溴酚蓝 (5)电泳级琼脂糖粉 (6)其他常备试剂如异丙醇、无水乙醇等均为分析纯。 (7)溴化乙啶 三、一1082A／G、一592C／A单核苷酸多态性基因型研究方法： l、血样采集： 用于提取纯化基因组DNA，避免反复冻融。 2、临床资料的收集： (1)临床资料根据患者的病史资料记录详细情况。同时排除资料不全或 难以判定的病例。将l临床特征做详细分类，均列入调查表中，再将 量表中的结果输入数据库。 3、细胞DNA的提取： (1)细胞裂解(cell lysis)： ①于1．5ml无菌EP管中加入900ul红细胞裂解液，再加入300 正l全血，在室温下放置1分钟并同时翻转lO次使两者混匀。 团白细胞沉淀，吸去悬浮液，留少许残余液和白细胞团块于管中。 ③于振荡