Pin1与cyclin+D1在急性白血病中的表达及意义.pdfVIP

郑州大学2007届硕士研究生毕业论文Pinl与CyclinD】在急性白血病中的袁达及意义 材料与方法 1．标本 2006年5月至12月郑州大学第一附属医院血液科门诊及住院初治急性白血瘸 患者和非恶性血液病患者的骨髓标本。年龄范围10—75岁(中位年龄35岁)，所 有病例均经骨髓细胞形态学，细胞免疫化学染色及流式细胞仪确诊，符合FAB白 血病分型标准。 2．分组及临床资料收集 2．1初治急性白血病组 分别已录每例患者年龄、性别、外周血白细胞计数、血红蛋白浓度、血小板 计数和骨髓原始细胞比例等临床资料。将全部急性自血病患者分为：①急性淋巴 M12例，M220例，M37例，M43例，M53例，M62例，M71例。 2．2急性白血病完全缓解组 留取初治组完全缓解后标本，其中AML-CR组24例，ALL-CR组11例。 2．3对照组(Contr01) 正常对照15例，均为骨髓检查正常的非恶性血液病者。 3+主要试剂 EDTA．2Na，溶于100ml三蒸水中，调节值至8．0左右，待其充分溶解后，即成为 2％乙二胺四乙酸．二钠(EDTA．2Na)溶液。高压消毒后置于4C冰箱保存。 3．2 buffered saline,磷酸盐缓冲液)：：NaCI PBS(Phosphate 99，Na2HP04． 12H20略，NaH2P04．2H20 0．49溶于1000ml蒸馏水中，待其充分溶解后，调节pH 值7，2～7，6，高压消毒后置于4C冰箱保存。 3．3防脱片：北京中杉金桥技术有限公司。 3．4淋巴细胞分离液：上海恒信化学试剂有限公司产品，250ml／瓶，4℃冰箱 保存。 3．5 DAB显色剂；北京中杉金桥生物技术有限公司，浓缩型(20x)，自带稀 郑州大学2007届顿士研究生毕业论文Pinl与Cvclin 1)l在鲁住臼血趣!鲤壅垄丛童墨 释液，4C冰箱保存，备用。 D1鼠抗人单克隆 3．6浓缩型Pinl兔抗人多克隆抗体(11111)、浓缩型Cyclin 冰箱保存。 3．7 PBS(o．JM)中，60。C充分溶 4％多聚甲醛：将209多聚甲醛加于300ml 解，4℃冰箱保存备用。 3．8通用型S-P试剂盒：购于北京中杉会桥生物技术有限公司。s-P免疫标记 试剂盒组成：A即用型3％H202过氧化物酶阻断剂；B即用型封闭用正常山羊血 清；C即用型通用型生物素标记的第二抗体；D即用型辣根酶标记链霉卵白素。 3．9苏木素：由郑州大学医学院组胚教研室赠。 4．主要仪器 4，1 离心机：上海安亭科学仪器厂 4．2 冰箱：新乡新飞 4．3 天平：上海第二天平仪器厂 4．4 恒温干燥箱：HW-3型，广东东方红医疗器械厂 4．5 加样枪：上海荣泰生化工程有限公司 4．6 光学显微镜：f1本OLYMPUS公司 4．7 灭菌压力锅：日产HmIHAMA公司 4．8 各种耗材：枪头、滴管、试管、烧杯等，郑州大学血液病研究所 5，主要实验方法 5．1 标本的制各 5．1．1 慢加入另一装有2ml淋巴细胞分离液的试管中，使两者界面清晰。 51．2在水平离心机上以2000转／分离心30分钟。 5．1．3离心后管内液体分三层；上层为血浆和PBS液，下层为红细胞和粒细 胞，中层为淋巴细胞分离液，上、中层界面处有一单个核细胞为主的白色云雾状 狭窄带。以吸管插入云雾层，吸取单个核细胞，簧入另一个试管中，加入2倍的 PBS液将管底细胞 PBS液，1000转，分离心10分钟，弃上清，保留管底细胞，2ml 稀释后，以1000转／分离心