人山羊异种核移植胚胎发育初步研究.docVIP

人-山羊异种核移植胚胎发育的初步研究 　　摘 要：以体外分离培养的人胚胎成纤维细胞为核供体，经血清饥饿培养后，通过显微操作技术移入山羊去核卵母细胞中，采用化学方法激活重组胚。通过体外培养观察，2-细胞胚胎发育率可达51．33％，4-细胞发育率为31．42％，但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减少，仅为9．73％。虽然目前尚未能获得异种核移植囊胚，但实验结果说明山羊成熟卯母细胞可以支持人体细胞核完成重编程， 人-山羊异种体细胞核移植重组胚可在体外完成其早期发育。 　　关键词：异种核移植；人：山羊；卵母细胞 　　中图分类号：Q813；R329 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)01―0050―05 　　治疗性克隆(Therapeutic ccloning)是指以患者 的体细胞作为供核，移入去核的卵母细胞内，将重 构胚培育至囊胚，从内细胞团中分离出胚胎干细 胞，为患者提供与其自身遗传物质一致的组织细 胞或器官，用于患者疾病的治疗。目前，治疗性 克隆存在的问题主要有：核移植总体效率很低、卵 母细胞来源及质量不稳定、供核细胞种类的选择、 操作水平、体外培养条件等。由于人类卵母细胞来 源非常有限，且受到法律、伦理等多种因素的限 制，很难获得足够数量的人卵母细胞用于实验研 究，异种核移植技术的出现为解决这一难题提供 了可能，目前已建立了使用兔卵母细胞的异种体 细胞核移植胚胎干细胞，但胚胎发育率较低。本 研究旨在对山羊成熟卵母细胞能否支持人体细胞 核的重编程，并使重组胚获得一定程度的发育进 行初步探索，以便为将来利用动物卵母细胞来获 取治疗性克隆所需的胚胎干细胞奠定基础。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 材料 　　1．1．1 胚胎组织 　　胎龄5-9周人工终止妊娠的废弃胚胎，要求 胚体完整，无严重污染，废弃胚胎由解放军第四 军医大学唐都医院妇产科提供．使用前征得患者 同意，签署知情同意书，并获得学校医学伦理委员 会的批准。 　　 　　1．1．2 山羊卵巢 　　采集于陕西省西安市屠宰场．采集的卵巢置 于20-30℃含0.32g／L硫酸庆大霉素的生理盐 水中，6~8 h运回实验室。 　　 　　1．1.3 主要试剂 　　DMEM培养液、M199培养液、SOF培养液、胎 牛血清(FBS)购自GIBCO公司；二甲基亚砜 (DMSO)、离子霉素(10nomycin)、6－二甲氨基嘌呤 (6-DMAP)、Hoechst33342、细胞松弛素B(CCB)、 透明质酸酶、胰蛋白酶、EDTA、聚乙烯吡咯酮 (PVP)、矿物油购自Sigma公司；磷酸缓冲液 (PBS)自配。 　　 　　1．1，4 仪器设备 　　细胞培养箱(Heraus，西德)、实体显微镜 (Olympus)、显微操作仪(Nikon)， 　　 　　1.2 方法 　　1，2，l 山羊卵母细胞的体外成熟 　　将卵巢系膜剪去，用温生理盐水冲洗后置于 含10mg／L肝素的PBS液中，用切剖法采集卵斤 卵母细胞复合体(cumlllus-oocyte complexes， COCs)，在实体显微镜下检查回收，将收集的 COCs在PBS中清洗3次，再H―M199 (M199+10％FBS+10 mg／L FSH+20 mg／LLH) 洗1次后置于H―M199中进行体外成熟培养，培 养条件为38．5 t、5％CO2、饱和湿度． 　　 　　1.2.2 成熟山羊卵母细胞的去核 　　体外成熟培养18～20 h后，将COCs置于 0．2％透明质酸酶中消化，轻轻吹打，使卵母细胞 周围的卵丘细胞脱落，选择排出第一极体的卵母 细胞在H―M199中清洗3次，置于含5 mg／L CCB 和10％FBS的PBS微滴中，38．5℃、5％C02、饱 和湿度孵育10 rain，在显微操作仪下用持卵针固 定卵母细胞，使第一极体在镜下位于2点至4点钟 的位置，用外径为20～30μm的去核针吸取第一 极体及其周围1／4--1／3的细胞质进行去核。去核 后的卵母细胞用1 mg／L Hoechst33342染色15 rain，然后在荧光显微镜上检查去核情况，挑选出 完全去核的卵母细胞作为核移植受体，见图1。 　　 　　1.2.3 人胚胎成纤维细胞的分离培养 　　用含青链霉素的PBS浸洗胎儿3―5次，实 体显微镜下去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部 组织以PBS冲洗充分除去红细胞后剪碎至I mm3 大小，0．25％胰蛋白酶-0．04％EDTA混合消化 液室温下作用3-5 min，加入等量DMEM+10％ (v／v)FBS培养液终止消化，800~--t 000r／min离 心3-~5 min，弃上清液，加入前述培养液悬浮细 胞，调整细胞密度在105～1