亚硒酸钠对延边奶山羊乳腺上皮细胞过氧化氢所致氧化损伤保护作用.docVIP

亚硒酸钠对延边奶山羊乳腺上皮细胞过氧化氢所致氧化损伤的保护作用 　　摘要：研究了亚硒酸钠对过氧化氢导致的延边奶山羊乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用。将延边奶山羊乳腺上皮细胞分为3组：正常组（对照组1）、过氧化氢损伤组（对照组2）、亚硒酸钠保护组。MTT方法检测细胞活力，Hoechst33342/PI 双染、Giemsa染色法检测细胞凋亡情况，DHE染色法检测细胞内ROS含量。结果表明，与对照组2相比，浓度为0.25、0.5、1.0 μg/mL的亚硒酸钠保护组的延边奶山羊乳腺上皮细胞活力上升，细胞凋亡数目减少，活性氧含量减少。其中以0.5 μg/mL亚硒酸钠处理组效果最显著。说明0.5 μg/mL的亚硒酸钠可以减少过氧化氢所致的延边奶山羊乳腺上皮细胞的氧化损伤，提高细胞活力，抑制细胞凋亡，减少细胞内ROS含量。表明亚硒酸钠对延边奶山羊乳腺上皮细胞过氧化氢所致氧化损伤具有保护作用。 　　关键词：亚硒酸钠；乳腺上皮细胞；氧化损伤；凋亡 　　中图分类号： S827.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0155-04 　　收稿日期：2013-07-23 　　基金项目：吉林省科技厅重点项目（编号。 　　作者简介：孙婧陶（1990―），女，河北承德人，硕士，主要从事动物繁殖与生物技术研究。E-mail：sunjt1990@126.com。 　　通信作者：方南洙（1960―），男，朝鲜族，博士，教授，主要从事动物繁殖与生物技术研究。E-mail：nzfang@。有氧代谢会产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括羟基自由基（?OH）、超氧化物阴离子（ O-2? ）、单线态氧（1O2）及过氧化氢（H2O2），这些物质会在生物体内不断生成[1]。细胞自身的抗氧化功能会使细胞处于平衡状态，但是当这种平衡一旦被打乱，细胞即处于氧化应激状态下。氧化应激存在时，这种氧化损伤会导致一些至关重要的生物分子（包括诱导氧化损伤的基因组）聚集，最终导致一些生物效应，比如信号传导的改变、与有丝分裂相关表达基因的改变、突变及细胞死亡[2-3]等。凋亡（细胞程序性死亡），是细胞参与的自我破坏的一种细胞死亡形式，该过程伴随着细胞一系列典型的形态变化及生物化学变化[4]，包括细胞缩小、染色质固缩、DNA核小体间的裂解[5]。细胞凋亡与坏死尽管都能造成细胞死亡，但是二者是不同的。为了防止坏死，受到破坏细胞的细胞膜破裂，紧接着会向细胞内基质释放酶，造成炎症反应。已经有研究证明ROS和氧化损伤与细胞凋亡是有关联的[6-8]。低剂量的H2O2通过产生羟基自由基（?OH）和改变氧化/抗氧化途径来诱导凋亡[9]。 　　硒对于维持各种各样生理活动是必要的一种元素[10]，同时硒是GSH-Px的成分，具有抗氧化的作用，它是生物体内重要的活性氧自由基清除剂，以Sec（含硒半胱氨酸）的形式发挥作用，硒参与构成了它的生物活性中心。GSH-Px用来调节细胞内和细胞间过氧化氢浓度[11]。硒元素与维生素E一样被认为在清除自由基方面能够发挥重要作用[12-13]。在细胞培养中，硒元素以亚硒酸钠的形式存在，通过减少自由基及抑制脂质过氧化物来保护细胞免受氧化伤害[14-17]。Gopalakrishina 等研究称，向骨髓间质细胞的培养基中添加硒元素，可以很好地使细胞抗氧化功能恢复从而降低对细胞的伤害[18]。因此，向培养基中添加亚硒酸钠可以对受到氧化损伤的细胞进行保护。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　主要试剂：胎牛血清（fetaL bovine serum，FBS）购自GIBCO；姬姆萨（Giemsa）染液购自贝索生物科技有限公司；其他药品，均购自SIGMA公司。 　　1.2方法 　　1.2.1延边奶山羊乳腺上皮细胞（DGMECs）的培养乳腺上皮细胞用含10% FBS的DMEM/F12培养液培养，同时加入100 mg/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、5 μg/mL胰岛素。培养条件为38 ℃、5% CO2、饱和湿度。乳腺上皮细胞传代采用胰蛋白酶消化法，细胞达到80%融合状态时，用温水浴后的PBS洗涤2次，加入0.15 %Trypsin-0.02 %EDTA，置于培养箱中，消化4～5 min，在倒置显微镜下观察消化情况，待细胞收缩变圆时，用含有10% FBS的DMEM/F12培养液终止消化，吹打使细胞脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心，接种（图1）。 　　1.2.2H2O2诱导氧化损伤模型的建立参照先前研究[19]，选取可以导致40%～50%细胞凋亡的100 μmol/L的H2O2作用4 h建立氧化损伤模型。 　　1.2.3亚硒酸钠（Sodium seLenite，SS）的配制用超纯水