吡格列酮对急性脑缺血再灌注损伤大鼠TNF―αIL―10和细胞凋亡影响.docVIP

吡格列酮对急性脑缺血再灌注损伤大鼠TNF―αIL―10和细胞凋亡影响 　　[摘要] 目的 探讨急性脑缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）和细胞凋亡的变化规律及吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）干预对上述指标的影响。 方法 将84只SD大鼠随机分为PGZ组（n=42）及对照组（n=42），前者通过改良Zea-longa法建立脑缺血再灌注损伤模型后立即经尾静脉注射10 mg/kg的PGZ，对照组则用同等剂量的生理盐水代替PGZ，以后各组分别每24小时腹腔注射1次等量PGZ/生理盐水，直至SD大鼠被处死，并以伤后处死时间分为7个亚组，分别为1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每个亚组各6只。取缺血灶周围组织采用免疫组织化学方法检测并比较脑组织中TNF-α及IL-10的蛋白表达，同时采用TUNEL法观察并比较细胞凋亡情况。 结果 PGZ组TNF-α蛋白表达量较对照组明显下降（P0.05），而IL-10显著上升（P0.05），且两组中二者均呈显著负相关（P0.01）；同时PGZ组脑组织细胞凋亡数量较对照组也有所下降（P0.05）。结论 脑缺血再灌注损伤后，吡格列酮可能通过降低TNF-α的活性上调IL-10的表达，减轻炎症反应，阻止神经细胞进一步凋亡，从而对缺血再灌注损伤大鼠神经细胞发挥保护作用。 　　[关键词] 吡格列酮；脑缺血再灌注损伤；TNF-α；IL-10；细胞凋亡 　　[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）35-0001-04 　　目前在2型糖尿病的治疗过程中，吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）在减少外周组织和肝脏的胰岛素抵抗、增加依赖胰岛素的葡萄糖处理、减少肝糖的输出方面具有重要意义。研究表明，吡格列酮对脑缺氧缺血、低血糖、创伤和癫痫发作时发挥的神经保护作用与激活过氧化物酶增殖体激活受体-γ（PPARγ）抑制炎症等途径有关[1]。然而，其具体神经保护分子机制还有待进一步研究。故本实验采用PGZ对改良Zea-longa 法建立大脑中动脉缺血再灌注损伤模型大鼠进行治疗干预，检测TNF-α、IL-10蛋白的表达及其对细胞凋亡的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤大鼠神经保护分子机制，为该药用于脑缺血缺氧性疾病的临床防治提供实验基础和理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验大鼠 　　选取84只清洁级雄性SD大鼠[浙江大学医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（浙）2008-0033]，体重（265±15）g。实验前大鼠禁食不禁水12 h，用随机数字表法分为PGZ组42只、对照组42只，再根据伤后处死时间分为7个亚组，分别为1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每个亚组各6只。 　　1.2 主要试剂 　　吡格列酮（PGZ）（美国Sigma公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-10（IL-10）免疫组化试剂盒（美国RD Systems公司）；TUNEL原位末端标记试剂盒（美国Promega公司）；电子显微镜（日本OLYMPUS公司）等。 　　1.3 大鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备及处理 　　灌注。模型成功标志[2]：大鼠苏醒后出现术侧Horner综合征；爬行时跌倒或向右侧转圈；提尾悬拉后出现缺血灶对侧上肢蜷缩屈曲。PGZ组待大鼠自然苏醒后立即经尾静脉注射PGZ 10 mg/kg，对照组则经尾静脉注射等量的生理盐水，以后各组分别每24小时经尾静脉注射一次等量PGZ/生理盐水，直至大鼠被处死。 　　1.4 观察指标 　　1.4.1 TNF-α及IL-10蛋白的表达 大鼠深度麻醉成功后，开胸暴露并游离出心脏，以生理盐水灌洗到双肺色白，后再灌注冰冻（4℃）4%多聚甲醛，迅速断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24 h。在距额叶前端2.5 mm和8.5 mm处行冠状切片，取中间5 mm厚的脑组织块，沿矢状缝左侧约1.5 mm处切除右侧部分，选取余下的左侧脑块作为检测标本，即缺血半暗带脑组织。自前往后连续冠状位切片，厚约6 μm，每隔10张取两张切片，严格按相关试剂盒提供的步骤进行检测，在400倍显微镜下随机取5个不重复视野，观察并计数阳性细胞数，求其平均值并采图。 　　1.4.2 TUNEL染色 严格按照TUNEL细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。在400倍光镜下观察凋亡细胞（以胞核出现棕黄染色颗粒代表），并计算计数阳性细胞数，求其平均值并采图。 　　1.5 统计学方法 　　应用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。计量资料用（x±s）表示，两组在不同时间点的指标比较分别采用两独立样本均数t检验与重复测量资料方差分析，组间因素为分组（PG