大孢粘球菌抗肿瘤活性蛋白WGF5分离方法优化与活性分析.docVIP

大孢粘球菌抗肿瘤活性蛋白WGF5分离方法优化与活性分析 　　摘 要 为从Myxococcus macrosporus STXZ54发酵液中高效地分离纯化出抗肿瘤活性蛋白WGF5，收集STXZ54发酵上清液，先后利用优化后的硫酸铵沉淀方法沉淀蛋白，强阳离子交换、分子筛色谱分离等方法对蛋白粗提物进行精细分离.利用CCK-8试剂盒，倒置显微镜、扫描电子显微镜等观察WGF5对肿瘤细胞形态的影响，台盼蓝染色进一步检测WGF5对肿瘤细胞的毒力.实验结果观察到WGF5能够显著改变肿瘤细胞形态，与原分离体系相比较，优化后的抗肿瘤活性蛋白分离方法更为高效，简便易行. 　　关键词 大孢粘球菌；抗肿瘤活性蛋白；方法优化 　　中图分类号 Q936文献标识码 A文章编号 1000-2537（2017）06-0044-05 　　Abstract The anti-tumor active protein WGF5 was isolated and purified from Myxococcus macrosporus STXZ54 fermentation broth by method optimization. Collected supernatant of STXZ54 and the protein WGF5 was separated by the optimized method of precipitating protein， including strong cation exchange and molecular sieve chromatography.The effect of WGF5 on the morphology of tumor cells was further examined by CCK-8 kit， inverted microscope， scanning electron microscope， and trypan blue staining.Our experimental results showed that WGF5 significantly affected tumor cell morphology， compared with the original separation system，our present optimized anti-tumor activity protein separation method is not only more efficient but also simpler. 　　Key words Myxococcus macrosporus； antitumor activity， separation method optimization 　　粘细菌（Myxobacteria）是一类具有独特复杂细胞行为的革兰氏阴性杆状细菌，在自然界中广泛存在于土壤、腐枝枯叶，甚至极端环境中[1].粘细菌在其生命活动中可以产生具有多种生物活性的次级代谢产物和衍生物[2-5]，具有抗菌、抗肿瘤等重要功能[6-12]，成为发现新型药物前体分子的重要资源.文也等[13]先后利用40%～75%硫酸铵分级沉淀方法分离发酵上清液中的蛋白质组分，弱阳离子交换色谱分离方法、分子筛色谱方法、反相色谱分离方法相结合从大孢粘球菌STXZ54中分离纯化出了单一的蛋白类活性物质WGF5.其相对分子质量大小为20 000，在常温下性质稳定，能够高效地抑制 B16，Hela，HCT-116，4T1及Hep-3b等多种肿瘤细胞的生长，属于高效广谱的抗肿瘤蛋白类活性物质.本研究通过全面优化WGF5的纯化方法，探究出更适合蛋白粗分离的硫酸铵梯度沉淀方法，以获得更多的目的蛋白.用强阳离子交换色谱柱代替弱阳离子交换柱，同时改变分子筛色谱的柱型与分离方法，快速高效地从大孢粘球菌STXZ54中分离得到WGF5，为该物质的大量制备提供更便捷有效的方法.冷场扫描电镜、台盼蓝染色等进一步分析了WGF5对肿瘤细胞的毒力，为其研发与应用提供参考. 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试菌株 Myxococcus macrosporus STXZ54，由本实验室分离纯化并鉴定的新菌株，菌种保藏号（CCTCC NO： M2014455）. 　　1.1.2 供试细胞株 小鼠黑色素瘤细胞（Murine Melanoma B16 cells）. 　　1.1.3 培养基 　　（1）Wax固体培养基：CaCl2?2H2O 1 g，HEPES 0.5 g，琼脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7.2； 　　（2）CTT固体培养基：酪蛋白胨 10 g，MgSO4?7H2O 8