大黄素对胃癌细胞BGC―823增殖和凋亡影响研究.docVIP

大黄素对胃癌细胞BGC―823增殖和凋亡影响研究 　　摘要：目的 研究大黄素对胃腺癌细胞BGC-823增殖及凋亡的影响。方法 采用细胞培养技术、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、流式细胞技术等试验方法，观察大黄素对BGC-823细胞生长和凋亡的影响。结论 BGC-823细胞在大蒜素作用后生长抑制、凋亡等形态学表现，大黄素对胃癌细胞有明显的抑制作用，且抑制作用与大黄素的浓度和作用时间呈正相关。结论 大黄素可显著抑制体外培养的胃癌细胞的生长，并具有诱导凋亡的作用，其抑制作用具有时效和量效关系。 　　关键词：大黄素；胃癌；凋亡；细胞周期 　　在我国，胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，占全部恶性肿瘤的第3位，占消化道肿瘤的首位。大黄素（Emodin，EM）是从大黄中提取的一种天然蒽醌类衍生物，是大黄、虎杖、何首乌、虎杖等多种中药的有效活性成分。其具有多种生物学功能，如抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、降血脂、保肝利胆等。本研究探讨大黄素对人胃癌细胞BGC-823细胞体外增殖和凋亡的影响，初步探讨大黄素用于胃癌治疗的可行性。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 　　1.1.1细胞系 人胃癌细胞BGC-823购自中国科学院上海细胞生物研究所。 　　1.1.2主要试剂及仪器 胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI 1640购自Gibco公司；大黄素（西安天丰生物科技有限公司），噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、谷氨酰胺均为美国Sigma公司产品；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自Molecular BiologyChemical公司。酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司），流式细胞仪（Beckman Coulter，美国贝克曼公司），离心机（Eppendorf公司），倒置显微镜（Olympus公司），CO2培养箱（日本三洋公司）。 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养 人胃癌细胞株BGC-823培养于含10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养液中，培养条件为37℃、5%CO2/95%空气，相对湿度为98%的环境，单层生长，取对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2 MTT法检测大黄素对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响 取对数生长期的胃癌细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl（含2×104个细胞），置37℃，98%湿度，5%CO2条件培养至细胞贴壁后，换新鲜培养基并加入不同浓度的大黄素（每一浓度设6个复孔）处理24、48、72h后，每孔加入90μl新鲜培养基和5%MTT 10μl，继续培养4h后弃上清，每孔再加入100μl DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定吸光值。细胞存活率=（实验组OD值-本底OD值）/（对照组OD值-本底OD值）×100%，实验重复3次。 　　1.2.3细胞凋亡检测 取对数生长期的胃癌细胞BGC-823接种于细胞培养皿，培养至细胞贴壁后，用不同浓度的大黄素处理48h后，消化细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度至1×109/L。取1mL细胞，1000 r/min 4℃离心10min，弃上清液。加入1mL冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 r/min 4℃离心10 min，弃上清液。将细胞重悬浮于400μl结合缓冲液，加入5μl Annexin V-F ITC，混匀后室温避光孵育15min后，加入10μl P I于室温避光放置5min后立即上机检测。Annexin V-FITC/PI法分别以525nm、620nm红色荧光和绿色荧光检测细胞，PI作为一种可嵌入DNA双链的红色荧光物质，不能通过完整的细胞膜，对活细胞和凋亡的细胞均不能染色，但可进入坏死细胞，因此可使坏死细胞发出红色荧光，通过荧光素标记的膜联蛋白（用于检测凋亡细胞外膜上的磷酯酰丝氨酸）和对细胞进行双染色，可将凋亡细胞、活细胞和坏死细胞区分开来。经流式细胞仪测量软件可直接测得每个样本10000个细胞中正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡细胞所占的比例。 　　1.2.4统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，统计分析方法根据实验设计的方案而定，实验数据用均数±标准差（x±s）表示，采用χ2检验和t检验，P0.05差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1形态学结果 倒置显微镜观察BGC-823胃癌细胞经不同浓度大黄素处理后形态的变化并拍照。镜下观察发现，未经药物处理的BGC-823胃癌细胞贴壁伸展，形态舒展，折光均匀，细胞核大而明显（图1A）。低浓度的水提物处理48 h后细胞收缩变小，与周围细胞分离，细胞核周围出现较多空泡样结构，细胞核物质边集（图1B），而高浓度的大黄素作用48h后，部分细胞出现细胞核异常凝集，核固缩和凋亡小体形成等典型的细胞凋亡形