大鼠局灶性脑缺血再灌注后肿瘤坏死因子表达变化及三七总皂苷作用研究.docVIP

大鼠局灶性脑缺血再灌注后肿瘤坏死因子表达变化及三七总皂苷作用研究 　　摘要：目的　研究三七总皂苷(PNS)对局部脑缺血再灌注后脑组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响，探讨PNS对缺血再灌注后神经元的保护作用。方法　参照ZeaLonga线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO)，100只SD大鼠随机分成假手术组、缺血再灌组和PNS治疗组。每组大鼠再随机分成4组，分别在再灌注后6h，24h，48h，96h处死。用免疫组化法检测缺血脑组织冷冻切片TNF-α的阳性表达。结果　假手术组脑内有极少量表达；缺血再灌组与PNS治疗组各时间点表达明显强于假手术组(P0.01)，PNS治疗组各时间点表达弱于缺血再灌组，阳性细胞数亦明显减少(P0.01)。结论　三七总皂苷对脑缺血再灌注后TNF-α的表达有降低趋势。 　　关键词：脑缺血；缺血再灌注；肿瘤坏死因子；三七总皂苷 　　中图分类号：R743.31　R285.5　文献标识码：A　文章编号：1672-1349(2007)07-0597-03 　　 　　在脑缺血再灌注损伤的重要机制之一――过度的炎症反应中，肿瘤坏死因子(TNF-α)是主要的致炎因子。本实验通过建立大鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO)脑缺血再灌注模型，观察脑缺血后TNF-α的阳性表达以及三七总皂苷(sapomons ofpanax notogmseng，PNS)对其的影响，进一步了解PNS在脑缺血后炎性反应中的作用及意义。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材料　100只成年健康SD大鼠，体重260g～300g，由上海实验动物中心提供。TNF-α免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，三七总皂苷由黑龙江珍宝岛制药有限公司提供。 　　1．2　动物分组　100只成年健康SD大鼠随机分成3组：假手术组(20只)，缺血再灌组(40只)，PNS治疗组(40只)。缺血再灌组、PNS治疗组大鼠均采用左侧大脑中动脉线栓法建立局部短暂脑缺血模型，缺血1h后拔出线栓颈外动脉段即为再灌注开始时间；假手术组手术操作除不插入线栓外其他同缺血再灌组，PNS治疗组大鼠在线栓堵塞大脑中动脉的同时腹腔内注射PNS(50mg/kg)。分别于术后6h，24h，48h，96h处死大鼠，断头取脑。取额极后部分脑组织行红四氮唑(TTC)染色，出现白色梗死区者，为MCAO模型成功。 　　1．3　标本制作及检测　取脑组织后每个取材点的后脑部分冷冻切片进行。TNF-α的免疫组化检测采用SABC染色，观测脑组织中微血管内皮细胞上的表达，免疫组化显色显微镜下观察着色呈棕褐色为阳性。 　　1．4　结果判定　脑缺血后皮层及纹状体区对缺血最敏感，损伤较明显，故着重观察皮层及纹状体区细胞变化。观察切片中阳性细胞数目及染色深浅程度。阳性结果定量，采用微量计数法(10目镜X40目镜)，以显色阳性的细胞数/高倍视野表示，并用显微镜定量图像分析仪进行分析。 　　1．5　统计学处理　应用SPSS 11.0软件处理，计量数据以均数±标准差(x±s)表示，建立数据库，采用方差分析及两两比较t检验。 　　 　　2　结果 　　 　　假手术组在大脑皮质和纹状体等部位可观察到TNF-α的弱阳性表达，说明正常情况下，脑内有少量的TNF-α表达，主要集中在神经元和微血管内皮细胞。缺血再灌组各时相点的TNF-α的表达较假手术组皆明显增强(P0.05)。PNS治疗组TNF-α阳性细胞的分布与缺血再灌组基本一致。PNS治疗组在各时点的TNF-α表达较假手术组皆明显增强(P0.01)，且表达强度随时间的变化规律与缺血再灌组相同，但是PNS治疗组再灌注各时点的TNF-α的阳性表达皆明显弱于缺血再灌组(P0.01)。 　　 　　3　讨论 　　 　　近年来，TNF-α在脑缺血再灌注损伤过程中的作用越来越引起人们的关注。TNF-α是一种缺血性脑损伤关键性介质，在中枢神经系统神经组织内不仅星形细胞、血管内皮细胞和小胶质可产生TNF―d，神经元亦可产生TNF-α。TNF-α在脑缺血损伤中的作用也是双重的，少量的TNF-α具有中枢保护作用，TNF-α诱导线粒体合成锰超氧歧化酶(Mn-SOD)等神经保护蛋白，也能诱导星形胶质表达生长因子。TNF-α可通过抗氧化途径保护神经细胞，增强神经元在再灌注过程中抵抗氧自由基的损害。说明TNF-α在脑组织损伤恢复及神经保护方面具有重要意义。但过量TNF-α可通过不同的机制诱导神经细胞损伤。在本研究中采用免疫组织化学的方法观察了脑缺血再灌注时TNF-α表达。结果显示在假手术组皮层海马区等部位可有少量TNF-α的表达，表明正常情况下脑内即有少量TNF-α的表达，自脑缺血再灌注6hTNF-α表达增强，阳性细胞数增加与假手术组比较有统计学意义(P0