姜黄素对肾癌786O细胞增殖及凋亡实验研究.docVIP

姜黄素对肾癌786O细胞增殖及凋亡实验研究 　　[摘要] 目的 观察姜黄素对肾癌786-O细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP蛋白）表达水平以及细胞凋亡的影响，研究姜黄素对肾癌细胞的生长抑制作用并探讨其分子机制，进一步揭示姜黄素对肾癌的治疗作用。 方法 不同浓度姜黄素作用人肾癌786-O细胞24、48、72 h后，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞的增殖抑制率；流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率；免疫细胞化学检测姜黄素对786-O细胞HIF-1α和XIAP表达的影响。 结果 姜黄素对人肾癌786-O细胞有明显的抑制作用，可引起细胞凋亡，并且存在剂量和时间依赖；不同浓度姜黄素作用细胞48 h后，HIF-1α和XIAP蛋白表达量下降。 结论 姜黄素通过下调HIF-1α和XIAP的表达抑制人肾癌786-O细胞的增殖，诱导人肾癌786-O细胞的凋亡。 　　[关键词] 姜黄素；786-O；凋亡；缺氧诱导因子-1α；X连锁凋亡抑制蛋白 　　[中图分类号] R284[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）04（b）-0019-03 　　姜黄素是姜黄根茎中存在的一种酚类物质，不少研究表明其对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制，但姜黄素作用于肾癌细胞的报道，国内外比较少见。本实验通过姜黄素对肾癌786-O细胞的干预，进一步研究姜黄素对肾癌细胞体外生长作用，探讨其在肾癌治疗中的可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株人肾癌786-O细胞（786-O细胞为国际公认肾透明细胞癌标准细胞）购自于山西医科大学寄生虫实验室。 　　1.1.2 主要化学试剂及药物RPMI-1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；姜黄素购自山东博科生物公司，纯度90%；MTT购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；羊抗人缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、羊抗人X连锁的凋亡抑制蛋白（XIAP）单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。 　　1.1.3 仪器美国Forma公司二氧化碳恒温培养箱，型号：3100；日本Olympus公司倒置照相显微镜，型号：BX51；中科院生物物理所全自动酶标仪，型号：ZS-2；美国BD公司流式细胞仪，型号：FACSCalibur。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 细胞培养将肾癌786-O细胞接种于含10%胎牛血清和青、链霉素的RPMI-1640培养基中，培养于5%CO2、37℃、95%饱和湿度细胞培养箱中。每3天传代1次，对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2 MTT实验检测姜黄素对786-O细胞增殖的影响将对数生长期的细胞用胰酶消化，调整为1×105/mL的细胞悬液，取96孔培养板，每孔加入100 μL细胞悬液，于细胞培养箱中培养至贴满瓶壁，倒掉培养液，加入姜黄素浓度分别为0、10、20、40、80 μmol/L的培养液200 μL（0 μmol/L为对照组），每个浓度组设5个复孔，放入细胞培养箱中分别培养24、48、72 h，显微镜下观察细胞并拍照，每孔加入MTT试剂20 μL，作用4 h。倒掉培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，低速摇床10 min。酶标仪程序设置在490 nm处，检测各孔吸光度OD值。计算肿瘤细胞抑制率公式：1－（实验孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%。 　　1.2.3 流式细胞仪检测姜黄素对786-O细胞凋亡的影响将对数生长期的细胞用胰酶消化，调整为1×106/mL的细胞悬液，接种于6孔培养板，放入细胞培养箱中培养至贴满瓶壁，倒掉培养液，加入姜黄素浓度分别为0、10、20、40、80 μmol/L的培养液（0 μmol/L为对照组），于细胞培养箱中培养48 h，加胰酶消化并收集细胞。按Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒步骤操作，各浓度取100 μL细胞悬液，放入流式细胞仪进行检测。 　　1.2.4 免疫细胞化学法测定姜黄素对786-O细胞HIF-1α、XIAP蛋白表达的影响将无菌盖玻片置于6孔板内，加入对数生长期的786-O细胞悬液，于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的细胞培养箱中培养至细胞贴壁生长于玻片后，加入姜黄素使终浓度分别为0、10、20、40、80 μmol/L（0 μmol/L为对照组），分别培养48 h。将细胞玻片取出，PBS漂洗3遍，多聚甲醛固定玻片15 min。免疫组织化学染色采用SABC法。PBS液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。医学图像分析系统分析免疫细胞化学结果。每组3张