TIF1-γ减低肾小管上皮细胞对TGFβ抑制增殖效应敏感性的研究-肾脏内科专业论文.docxVIP

目 录 HYPERLINK \l _bookmark0 摘要 - 1 - 前言 - 1 - HYPERLINK \l _bookmark1 材料与试剂 - 7 - HYPERLINK \l _bookmark2 1、细胞 - 7 - HYPERLINK \l _bookmark3 2、材料 - 7 - HYPERLINK \l _bookmark4 3、实验仪器: - 7 - HYPERLINK \l _bookmark5 4、常用试剂的配制 - 8 - HYPERLINK \l _bookmark6 试验方法 - 10 - HYPERLINK \l _bookmark7 1、细胞复苏 - 10 - HYPERLINK \l _bookmark8 2、细胞传代 - 10 - HYPERLINK \l _bookmark9 3、细胞冻存 - 10 - HYPERLINK \l _bookmark10 4、细胞培养，预感染 - 10 - HYPERLINK \l _bookmark11 5、感染，筛选，挑克隆 - 11 - HYPERLINK \l _bookmark12 6、实验分组 - 11 - HYPERLINK \l _bookmark13 7、总蛋白提取 - 11 - HYPERLINK \l _bookmark14 8、western blot 检测 - 12 - HYPERLINK \l _bookmark15 9、加入外源性的 TGF-β 和/或 TGF-β 受体激酶抑制剂 - 14 - HYPERLINK \l _bookmark16 10、MTT 细胞增殖活性实验 - 15 - HYPERLINK \l _bookmark17 11、统计学方法 - 15 - 结果 -16- 结论 - HYPERLINK \l _bookmark7 21- 讨论 - HYPERLINK \l _bookmark7 21- HYPERLINK \l _bookmark18 参考文献 - 24 - HYPERLINK \l _bookmark19 致谢 - 26 - 华 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 - - PAGE 10 - 摘 要 目的 利用 RNA 干扰技术，封闭转录中介因子 1-γ( transcriptional intermediary factor 1γ， TIF1-γ)在肾小管上皮细胞（HKC）中的表达，外源性的加入 TGF-β 或 / 及 TGF-β 受 体 酶 抑 制 剂 (SB431542) ， 探讨 TIF1-γ 在 转 化 生 长 因 子 β( transforming growth factor-β，TGF-β )诱导的肾纤维化中的作用。 方法 构建能表达针对 TIF1-γ的小干扰 RNA(siRNA)的慢病毒载体，以及表达不 针对任何已知 mRNA 的 siRNA 的阴性对照载体，分别感染人肾小管上皮细胞株 (HKC)，得到 TIF1-γ表达受抑制的 HKC- siTIF1-γ和 TIF1-γ表达未受影响的 HKC-siControl。将培养的细胞分为 3 组：正常 HKC 组，HKC-siTIF1-γ组及 HKC-siControl 组，然后加入外源性的 TGF-β 或/及 SB431542，72h 后，分别采 用四唑盐（MTT）比色法实验和 western blot 检测，并分析 TIF1-γ在 TGF-β 抑 制肾小管上皮细胞增殖效应中的作用。 结果 没有加入 TGF-β 时，三组细胞生长活力差异不大，当只加入 TGF-β，三 组细胞生长活力均受到明显抑制，同时加入 TGF-β 及 SB431542 时，三组细胞 生长活力略有抑制。并且正常 HKC 组和 HKC-siControl 组中 TIF1-γ正常表达， TGF-β 抑制肾小管上皮细胞增殖的作用相当，但在 HKC - siTIF1-γ组中 TIF1-γ 的表达受到明显抑制，几乎不表达时，TGF-β 抑制肾小管上皮细胞增殖的作用比 正常 HKC 组和 HKC-siControl 组要强很多，差异具有统计学意义。换另一种方 式来解释就是，因为 TIF1-γ 的表达，肾小管上皮细胞对 TGF-β抑制增殖效应 的敏感性降低。TIF1-γ的表达和 TGF-β 抑制肾小管上皮细胞增殖效应呈显著负 相关。 结论 TIF1-γ的表达明显减低 HKC 对 TGFβ抑制增殖效应的敏感性，提示 TIF1- γ在 TGF-β 诱导的肾纤维化中的有重要作用。 关键词 转录中介因子 1-γ；肾小管上皮细胞；转化生长因子β；感染复数 Abstract