TIGAR在肝癌细胞对表阿霉素耐药中的作用及相关机制研究-外科学(普通外科学)专业论文.docxVIP

TIGA TIGAR 在肝癌细胞对表阿霉素耐药中的作用及相关机制研究 中文摘要 I I PAGE IV PAGE IV TIGAR 在肝癌细胞对表阿霉素耐药中 的作用及相关机制研究 中文摘要 目的：观察化疗药表阿霉素对肝癌细胞 p53 诱导的糖酵解和凋亡调节子（TIGAR） 蛋白表达的影响以及 TIGAR 在肝癌细胞对表阿霉素化疗耐受中的作用；探讨 TIGAR 影响肝癌细胞对表阿霉素耐药的初步机制。 方法：Western blot法检测表阿霉素对肝癌细胞TIGAR蛋白表达的影响；采用小 干扰RNA技术干扰肝癌细胞TIGAR表达后通过MTT及克隆形成实验分别检测干扰 TIGAR表达联合表阿霉素治疗对肝癌细胞生存的短期和长期影响；Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测干扰TIGAR表达联合表阿霉素治疗对肝癌细胞凋亡的影响；采用 慢病毒构建的TIGAR-shRNA感染HepG2肝癌细胞，经嘌呤霉素筛选，western blot及 细胞免疫荧光法检测干扰效率，得到稳转株后通过裸鼠成瘤实验检测干扰TIGAR表达 对肝癌肿瘤形成、生长及其对表阿霉素化疗疗效的影响；2’,7’-二氯二氢荧光素双醋 酸盐（DCFH2-DA）标记流式细胞术、GSH检测试剂盒及NADPH检测试剂盒分别检 测细胞内活性氧（ROS）水平、GSH/GSSG比值及NADPH水平；Western blot检测细 胞内凋亡相关蛋白水平；细胞免疫荧光法、western blot及电镜技术检测干扰TIGAR 表达对肝癌细胞自噬的影响；彗星实验检测细胞DNA损伤情况；采用细胞核质分离 技术分离细胞核后western blot分别检测胞浆及胞核中TIGAR的表达；运用细胞免疫荧 光及western blot技术检测DNA损伤修复中相关蛋白ATM、Cdk5等的表达。 结果：为了研究表阿霉素对肝癌细胞 TIGAR 表达的影响，我们采用不同浓度的 表阿霉素作用肝癌 HepG2 细胞不同时间后，western blot 检测 TIGAR 表达，结果显示， 低浓度短时间的表阿霉素作用可诱导 HepG2 肝癌细胞 TIGAR 表达，高浓度长时间的 表阿霉素作用后 TIGAR 表达下调。且表阿霉素诱导的 TIGAR 表达是依赖 p53 变化的。 为了进一步探讨表阿霉素诱导的肝癌细胞 TIGAR 高表达在肝癌细胞对表阿霉素疗效 中的作用，我们采用小干扰 RNA 干扰肝癌 HepG2 细胞 TIGAR 表达后通过 MTT、克 中文摘要 TIGAR 在肝癌细胞对表阿霉素耐药中的作用及相关机制研究 隆形成实验及流式等体外实验检测发现，干扰 TIGAR 表达联合表阿霉素作用后肝癌 HepG2 细胞的存活明显下降，细胞凋亡显著增加；此外，通过体内实验即裸鼠成瘤 实验检测干扰 TIGAR 表达对肝癌细胞成瘤的影响以及移植瘤对表阿霉素疗效的影 响，结果显示，干扰 TIGAR 表达抑制肝癌的形成和生长，同时也增加了其对表阿霉 素的化疗敏感性。研究还发现，不仅对于肝癌细胞，表阿霉素也增加了肺癌 A549 细 胞的 TIGAR 表达且干扰 TIGAR 表达增加肺癌 A549 细胞对表阿霉素的化疗敏感性。 肿瘤的化疗耐受与多种机制相关，其中 ROS 适应性反应、细胞自噬及细胞 DNA 损伤修复在肿瘤化疗耐药的形成中起着重要作用，TIGAR 作为 p53 下游基因，通过 抑制细胞糖酵解及增加磷酸戊糖通路产生 NADPH 降低细胞内 ROS 水平，从而降低 ROS 引起的细胞凋亡、ROS 介导的细胞自噬激活及 ROS 诱导的 DNA 损伤修复，此 外，磷酸戊糖通路的激活增加了 DNA 合成原料核苷酸的生成，有利于受损 DNA 的 修复。因此，为了进一步探讨干扰 TIGAR 表达在肝癌细胞对表阿霉素化疗增敏中的 机制，我们从细胞凋亡、细胞自噬及细胞 DNA 损伤修复三方面来进行研究。 第一，干扰 TIGAR 表达显著增加表阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡，并与 ROS 水平 增 加 、 Caspase3 激 活 相 关 。 采 用 NADPH 或 NAC 清 除 细 胞 ROS 水 平 或 采 用 Z-VAD-FMK 抑制 Caspase3 后可部分减轻细胞凋亡。提示，干扰 TIGAR 表达增加肝 癌细胞对表阿霉素化疗敏感性与干扰 TIGAR 表达增加细胞凋亡有关。 第二，干扰 TIGAR 表达显著增加表阿霉素诱导的肝癌细胞自噬激活，表现为 LC3 I 向 LC3 II 转化增加、自噬体增多及自噬底物 p62 蛋白水平的下调。干扰 TIGAR 表 达增加表阿霉素诱导的肝癌细胞自噬激活通过增加细胞 ROS 水平及抑制 mTOR 通路 来实现，NADPH 清除 ROS 后可部分抑制干扰 TIGAR 表达联合表阿霉素作用