TIG3在肝细胞癌中的表达及其作用的机制-内科学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 HYPERLINK \l _bookmark0 中文摘要 1 HYPERLINK \l _bookmark1 ABSTRACT 4 HYPERLINK \l _bookmark2 中英文对照缩略词表 8 HYPERLINK \l _bookmark3 前 言 9 HYPERLINK \l _bookmark4 1．材料和方法11 HYPERLINK \l _bookmark5 2．结 果 30 HYPERLINK \l _bookmark6 3. 讨 论34 HYPERLINK \l _bookmark7 4. 总 结 37 HYPERLINK \l _bookmark8 图 表38 HYPERLINK \l _bookmark9 参考文献 44 HYPERLINK \l _bookmark10 综 述48 HYPERLINK \l _bookmark11 致 谢55 中文摘 中文摘要 万方数据 万方数据 TIG3 在肝细胞癌中的表达及其作用的机制 硕士研究生：徐 言 导 师：聂玉强 教授 中文摘要 目的： 探讨 TIG3 在原发性肝细胞癌的表达及其作用的机制 方法： 1、临床组织标本上，通过免疫组织化学检测 42 对肝癌石蜡标本及癌旁正常 肝组织标本中 TIG3、Ki-67 的表达情况，然后统计学分析两者蛋白表达有无相关 性。 2、在体外细胞水平，通过实时定量 PCR 检测在正常肝细胞和肝癌细胞的 TIG3 表达情况。 3、将全长 TIG3cDNA 序列克隆到 GV141 过表达载体上，构建过表达 TIG3 基因重组质粒，并通过 PCR 及测序验证，然后再进行扩增和提取。 4、在 TIG3 内在表达水平最低的细胞，利用脂质体 2000 瞬时转染 TIG3 过 表达重组质粒，转染后定量 PCR 评估转染效果。 5、MTT 比色法及平板克隆实验检测过表达 TIG3 对肝癌细胞活力及增殖的 影响。 6、流式细胞仪检测过表达 TIG3 与肝癌细胞增殖周期的关系。 7、Transwell 分析过表达 TIG3 对肝癌细胞迁移的作用。 8、采用共聚焦免疫荧光技术探讨过表达 TIG3 对肝癌细胞凋亡的作用。 9、Western blot 检测过表达 TIG3 对细胞中 ERK1/2, p-ERK1/2, Caspase3, Cleave Caspase3,Bax 分子表达量的影响,推测 TIG3 分子参与的信号传导通路。 1 广州医 广州医科大学硕士学位论文 10、在体内裸鼠水平，肝癌细胞转染后采用 G418 维持筛选获得稳定转染 TIG3 肝癌细胞株，然后接种于 5-6 周雌性裸鼠皮下，每周测量其形成瘤体大小， 绘制生长曲线，4 周后杀死裸鼠，取裸鼠皮下瘤体再次测量其体积及重量。 结果： 1、在临床标本中，与邻近的非癌性肝组织相比，TIG3 在肝癌组织中低表达 （阳性率为 19.05% VS 76.19%,P0.001）。相反，Ki-67 呈高表达（阳性率为 61.9% VS 11.9%,P0.001）。同时，在肝癌组织中 TIG3 和 Ki-67 蛋白的表达呈显著负 相关（r=-0.443, P=0.005）。 2、在体外细胞水平上，相对于原代肝细胞和正常肝细胞，TIG3 在肝癌细胞 中的低表达，尤其在 Hep3B 肝癌细胞中其表达量最低。 3、重组过表达 TIG3 构建成功，质粒 PCR 及测序验证无误。 4、 转染过表达 TIG3 后，定量 PCR 分析显示 TIG3 的 mRNA 表达量增加约 4 倍, 过表达 TIG3 质粒成功转入 Hep3B 肝癌细胞中。 5、MTT 比色法检测出过表达 TIG3 可抑制肝癌细胞活力,同时平板克隆实验 也显示过表达 TIG3 可抑制肝癌细胞克隆的形成，明显抑制 Hep3B 肝癌细胞生长 增殖。 6、流式细胞仪检测结果表明，与阴性对照细胞相比，在 TIG3 过表达的细 胞中，S 期细胞数量明显减少，G1 期细胞数量显著增加，表明过表达 TIG3 抑制 Hep3B 肝癌细胞周期 G1 到 S 期的转换，阻断 Hep3B 肝癌细胞增殖。 7、Traswell分析发现转染过表达TIG3质粒的细胞，被结晶紫染色迁移的 Hep3B肝癌细胞明显减少，这说明TIG3具有明显抑制Hep3B肝癌细胞迁移的作 用。 8、共聚焦免疫荧光发现过表达 TIG3 可诱导活化 caspase3，使其表达量增加， 使 Hep3B 肝癌细胞出现核固缩、核溶解，微丝集聚浓缩、形成微丝环等细胞凋 亡现象的发生。 9、Western blot 发现两组总 ERK1/2 蛋白无明显变化（P＞0.05），但转染过 表达 TIG3 质粒组 p-ERK1/2 明显减少，而 Ca