TRPC1对丰富环境诱导的成年海马神经发生及认知功能增强的影响及其机制研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 1万方数据 PAGE 1 万方数据 摘要 背景 丰富环境（environmental enrichment，EE）与海马可塑性有关，其中包括增加 神经发生和改善认知能力等。而且，丰富环境还可以改善压力、老化以及神经系统疾 病等引起的脑功能损伤。丰富环境调节海马可塑性和改善脑功能的机制非常复杂，至 今仍不十分清楚。经典瞬时受体电位 1(transient receptor potential1-canonical， TRPC1) 通道是 Ca2+通透的、非选择性的阳离子膜通道，在大脑中选择性的表达在神经 元中，并且主要是表达在神经元的胞体和树突。研究表明 TRPC1 通道参与调节胚胎神 经干细胞(neural stem cells，NSCs)的自我更新、神经突延伸生长以及促进细胞周 期进程和细胞增殖 等 。此外，近期研究 发 现 TRPC1 介 导 的 钙 库 操 纵 性 钙 内 流 (store-operated Ca2+entry，SOCE)增加对于体外培养的成年海马神经组细胞的增殖 是必需的。这些研究结果提示 TRPC1 可能在神经祖细胞(neural progenitor cells， NPCs)增殖、海马可塑性以及学习记忆等过程中起着重要作用。但是，丰富环境诱导 的成年神经发生和认知功能增强是否由 TRPC1 及相关信号通路介导，目前还尚未见报 道。 目的 1. 探讨丰富环境对 TRPC1 的影响。 2. 探讨 TRPC1 在丰富环境增强成年海马神经发生和认知功能中的作用。 3. 探讨 TRPC1 参与调节丰富环境增强成年海马神经发生和认知功能的机制。 方法 将成年（8-10 周龄）野生型（wild-type，WT）129/SvEv 雄性小鼠和此基因背景 下的 TRPC1-/-雄性小鼠分别随机分配到标准笼（standard cage，SC；每笼 4 只）和丰 富环境（environmental enrichment，EE；每笼 12 只）笼中，每笼中两种小鼠参半。 采用实时定量 PCR（Real Time PCR）与蛋白免疫印迹（Western blot）等实验技术检 测丰富环境对 TRPC1 mRNA 与蛋白表达水平的影响。腹腔注射 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 （5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU）来标记新生神经组细胞，用免疫荧光技术来研究 WT 与 TRPC1-/-小鼠海马新生神经组细胞的增殖、分化和存活情况。通过行为学测试及 记录海马脑片苔状纤维(mossy fiber，MF)--海马 CA3（即 MF-CA3）通路长时程增强 (long-term potentiation， LTP)来检测各组小鼠学习记忆及突触可塑性的变化情况。 而且，为了进一步证实 TRPC1 的作用，我们通过脑立体定位技术注射重组腺相关病毒 rAAV2-TRPC1 或 rAAV2-GFP（作为对照）到各组小鼠海马齿状回(dentate gyrus，DG)， 并评估这些小鼠在丰富环境后神经发生及认知记忆水平。此外，应用 Western blot 检 测 MAPK 家族成员及 CREB 蛋白等表达水平变化来探讨其内在机制。 结果 1.丰富环境显著增加成年小鼠海马 TRPC1 表达水平。 成年（8-10 周龄）WT 小鼠随机分别饲养于标准笼(standard cage，SC)与丰富环 境 (environmental enrichment，EE)中。四周后，我们用实时定量 PCR 和蛋白免疫 印迹等实验技术检测到 EE 组小鼠 TRPC1 mRNA 和蛋白表达水平显著高于 SC 组小鼠。 2．成年 TRPC1-/-小鼠表现出丰富环境诱导的海马神经发生及认知功能增强障碍。 （1）免疫荧光结果显示：丰富环境使 WT 小鼠神经祖细胞增值及新生神经元存活 率显著增加了，而 TRPC1-/-小鼠在丰富环境后神经祖细胞增值及新生神经元存活率并 没有明显的变化。 （2）行为学检测结果显示：丰富环境使 WT 小鼠在 Morris 水迷宫中逃避潜伏期 显著降低和在目标象限花更长的时间搜索平台，在关联条件恐惧中凝滞反应时间显著 增加，在新物体识别实验中明显更加倾向于对新物体进行探索，而 TRPC1-/-小鼠丰富 环境后在上述行为学测试中的表现并没有明显的改变。 （3）脑片 LTP 记录结果显示：丰富环境显著性地增加了 WT 组小鼠海马脑片 MF-CA3 通路兴奋性突触后场电位 (field excitatory postsynaptic potentials， fEPSP)的斜率，而丰富环境后在 TRPC1-/-组小鼠的海马脑片中并没有检测到 fEPSP 斜 率有明