TRPC6介导的钙离子内流在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用-内科学肾脏病专业论文.docxVIP

华中科技大学博士 学位论 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 4 PAGE 4 摘 要 蛋白尿不仅是足细胞损伤的主要临床表现，也是导致足细胞损伤进行性发展的重 要原因之一[19]。白蛋白是尿蛋白的主要成分，已有的实验研究主要集中在其对肾小管 上皮细胞的损伤如诱导其凋亡以及促进肾间质纤维化[20]，而其在足细胞的直接损伤中 作用尚未引起足够重视。蛋白尿状态下，足细胞首先暴露在大量白蛋白的环境中，其 呈指状交叉的足突结构以及足突间裂孔隔膜分子可能受到蛋白负荷的影响而加剧足 细胞的损伤，同时足细胞的损伤又将导致蛋白尿病情加重，如此形成恶性循环[21]。 TRPC6 是新近发现的足细胞裂孔隔膜蛋白之一，也是一种非选择性阳离子通道蛋白， 其主要通过介导钙离子内流发挥作用。已有的研究证实，在多种蛋白尿性肾脏病以及 足细胞损伤的体外模型中足细胞 TRPC6 表达量增高，并与足细胞损伤程度相一致[22]。 由此推测 TRPC6 介导的钙离子内流是足细胞损伤的始动因素之一。然而，白蛋白过 负荷对 TRPC6 离子通道功能的影响及其对足细胞的直接作用至今尚未明确。 本研究拟采用白蛋白过负荷体外细胞模型，探讨 TRPC6 在白蛋白过负荷所致足 细胞损伤中的作用，并初步研究 TRPC6 通道在白蛋白过负荷状态下功能和表达量的 改变，以期进一步阐明 TRPC6 介导的钙离子内流在蛋白尿所致足细胞损伤中的作用 机理，并为蛋白尿的治疗提供潜在靶点。本实验研究具体内容概述如下： 目的：探讨 TRPC6 在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用。 方法： 体外培养条件永生化小鼠足细胞, 分为：空白对照组；白蛋白刺激组； pEGFP-N1 转染组；TRPC6 高表达质粒 mTRPC6-EGFP 转染组；scramble siRNA 转染 组； TRPC6 siRNA 转染组； TRPC 通道阻滞剂 SKF-96365 干预组； F-actin 细胞骨 架稳定剂 Jasplakinolide 干预组。 (1) 以 Fluo 3-AM 为钙离子探针，采用活细胞钙成 像法检测白蛋白瞬时刺激对各组足细胞胞内钙离子浓度的影响。(2) Western blot 法检 测白蛋白过负荷后足细胞孔隔膜分子 TRPC6 和 nephrin，内质网应激相关蛋白 GRP 78 以及 caspase-12 表达的的改变。(3) 免疫荧光法检测白蛋白过负荷对足细胞损伤标志 物 desmin 表达的影响。(4) 以罗丹明标记的鬼笔环肽对足细胞 F-actin 细胞骨架染色， 观察白蛋白过负荷对足细胞 F-actin 细胞骨架结构的影响。(5) Hoechst 33342 活细胞染 核观察白蛋白过负荷引发的足细胞凋亡及其细胞核形态的改变。(6)采用 Annexin V-FITC 和 propidium iodide 双染法以流式细胞仪检测白蛋白过负荷所致足细胞凋亡 率的改变。 结果：(1) 大量白蛋白瞬时刺激可激发足细胞胞浆内钙离子浓度短时间内一过性 增高，且呈白蛋白浓度依赖性。20 mg/ml 白蛋白刺激引起的胞内钙离子增加幅度最为 明显。分别以 EGTA 或 thapsigargin 预处理，以清除细胞外钙或阻断细胞内钙池，发 现白蛋白刺激不但可激发细胞外钙离子内流还可引起胞内钙池钙离子释放。转染 TRPC6 高表达质粒后，足细胞对白蛋白刺激敏感性增加。而 TRPC6 siRNA 或 TRPC 通道阻滞剂 SKF-96365 可明显阻断白蛋白刺激引发的足细胞胞内钙离子浓度增高。(2) 白蛋白过负荷后 48 h，足细胞 TRPC6 蛋白表达量明显增高。而 TRPC6 siRNA 可明显 抑制 TRPC6 蛋白表达。(3) 20 mg/ml 白蛋白孵育后 48 h 可引起足细胞 desmin 蛋白表 达量显著增高，阻断 TRPC6 可改善 desmin 蛋白表达。(4)72 h 白蛋白过负荷可导致足 细胞 F-actin 细胞骨架结构破坏，与 F-actin 稳定剂 jasplakinolide 作用类似，阻断 TRPC6 可在一定程度上稳定足细胞骨架结构。(5) 白蛋白过负荷 48 h 后足细胞 GRP 78 蛋白 表达量增加，延长白蛋白刺激时间至 72 h 后足细胞内活化的 caspase-12 表达量增高。 TRPC6 siRNA 可部分阻断 GRP 78 蛋白表达和 caspase-12 蛋白活化。(6) 20 mg/ml 白 蛋白孵育后 96 h，足细胞凋亡数目明显增加，其形态学表现为细胞核呈质密浓染或碎 片状质密浓染。(7) 流式细胞仪分析结果显示，白蛋白过负荷引起足细胞凋亡率增加。 阻断 TRPC6 蛋白表达或其通道功能，以及稳定足细胞骨架结构可降