TLR3基因在BeWo细胞HBV感染与清除中的作用-流行病与卫生统计学专业论文.docxVIP

山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 II II 目的： TLR3 基因在 BeWo 细胞 HBV 感染和清除中的作用 中文摘要 ①探讨 HBV 刺激不同 TLR3 表达水平的 BeWo 细胞后，各组 BeWo 细胞 TLR3 蛋白表达 与 HBV 感染与复制的关系； ②探讨 HBV 刺激不同 TLR3 表达水平的 BeWo 细胞后，各组 BeWo 细胞分泌 TLR3 信号 转导过程中相关细胞因子的水平与 HBV 感染与复制的关系。 方法： ①利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 将抑制TLR3 基因的质粒pEGFP-Genesil-tlr3 转 染入BeWo细胞，以下调BeWo细胞的TLR3 表达；用 40ug/mlPolyI:C刺激BeWo细胞以上调 TLR3 蛋白的表达，然后用HBV感染各组细胞； ②本次实验采用BeWo细胞与 100ul HBV DNA含量为 5.0×106（copies/ml）的病人血清共 同培养作为HBV感染的方法，共设立四个组：正常对照组、HBV刺激正常细胞组、HBV 刺激抑制TLR3 质粒转染组、PolyI:C+HBV刺激组，于HBV刺激各组细胞 8h、16h、24h、 48h后收集各组细胞的培养上清及细胞进行下一步实验； ③用流式细胞术（FACS）测定以上各组细胞 TLR3 蛋白的表达量，并分析不同 HBV 刺激 时间点下 TLR3 蛋白表达水平的变化；用荧光定量 PCR 法检测 HBV 刺激后各组细胞培养 上清中的 HBV DNA 载量； ④用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组细胞培养上清中 IL-10、TNF-α、IFN-β的表达。 结果： ① PolyI:C 刺激 BeWo 细胞后，TLR3 蛋白表达量增加，其平均荧光强度为 65.11±2.73， 正常对照组细胞为 53.27±4.45，差异有统计学意义（t=-4.536，P0.05）。 ② 将抑制 TLR3 的质粒（pEGFP-Genesil-tlr3）用脂质体转染法转染入 BeWo 细胞后，其 平均转染效率为 50.24%。 ③ 用 FACS 检测不同时间点(8h、16h、24h、48h)HBV 刺激各组 BeWo 细胞的 TLR3 蛋白 表达量，其在四个实验组中的 4 个不同时间点上差异均有统计学差异（P0.05）。正常对 照组 BeWo 细胞在 4 个时间点上 TLR3 蛋白平均荧光强度分别为 52.88、53.78、55.07、54.70； HBV 刺激 BeWo 细胞可使 TLR3 蛋白水平升高，在 8h 为 62.50，16h 为 69.65，24h 为 71.78， 48h 为 73.49，且随时间变化 TLR3 蛋白表达水平有升高趋势；PolyI:C +HBV 刺激组 TLR3 蛋白表达量高于正常对照组及 HBV 刺激正常细胞组，8h 为 77.27，16h 为 85.36，24h 为 91.26，48h 为 88.27，在 24h 时 TLR3 蛋白表达量达到高峰；HBV 刺激抑制 TLR3 质粒转 染组 TLR3 蛋白表达量先下降再升高，其在 8h 为 46.19，16h 为 45.96，24h 为 46.34，48h 为 49.55，与正常对照组相比，除在 48h 差异无统计学意义（P0.05）外，其他时间点均 III III 有统计学差异（P0.05）。 ④ 用荧光定量 PCR 法检测 HBV 刺激正常细胞组、PolyI:C+HBV 刺激组和 HBV 刺激抑制 TLR3 质粒转染组的不同 HBV 刺激时间点（8h、16h、24h、48h）上各组细胞培养上清中 HBV DNA 拷贝数，结果显示三组间差异在 4 个时间点上均有统计学意义（P0.05），且 各组均随着 HBV 刺激时间的延长，HBV DNA 拷贝数降低。与 HBV 刺激正常组相比， PolyI:C+HBV 刺激组 HBV DNA 拷贝数较低，HBV 刺激抑制 TLR3 质粒转染组的 HBV DNA 拷贝数较高。 ⑤ 在 HBV 刺激的 4 个时间点(8h、16h、24h、48h)上，PolyI:C＋HBV 刺激组分泌细胞因 子 IL-10、TNF-α、IFN-β 的水平比 HBV 刺激正常细胞组高，差异均有统计学意义（P0.05）； HBV 刺激质粒转染组分泌的细胞因子水平低于 HBV 刺激正常细胞组，不同时间点上差异 也均有统计学意义（P0.05）。随着 HBV 刺激时间的延长，TNF-α表达水平在 8h 开始上 升，24h 达到高峰后开始下降；IL-10 和 IFN-β的表达水平在 PolyI:C+HBV 刺激组 16h 后 上升幅度较大，其余各组上升较为缓慢。 结论 ①HBV 刺激 BeWo 细胞后其 TLR