WboA基因在布鲁菌S2株诱导机体免疫应答中的作用-药理学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 摘 要 目的：以来源于我国常用的猪布鲁菌弱毒疫苗 S2 株的 WboA 基因缺陷株(简称 WboA-S2 株) 为实验菌株，并以 S2 株作为对照，体外观察 WboA-S2 株和 S2 株感染后的巨噬细胞 （macrophage, MΦ）和树突状细胞（dentritic cell, DC）形态学变化、吞噬率、细胞凋亡、 细胞因子产生及对 T 细胞的激活作用，探讨 WboA 基因编码产物在诱导机体抗感染免疫 中的作用，为以 WboA 基因作为靶基因的新型布鲁菌疫苗的研制提供实验依据。 方法： 1．WboA基因编码产物在布鲁菌感染MΦ、BMDC中的作用 制备小鼠腹腔MΦ和骨髓源性树突状细胞(BMDC)。用猪布鲁菌WboA-S2菌株以MOI 100：1，分别感染小鼠腹腔MΦ和BMDC，并以S2株作为对照，观察感染后的MΦ、BMDC 的形态学变化(1h、12h、24h)、吞噬率、载菌量(1h、6h、12h、24h)、凋亡率及分泌的 细胞因子(24h、48h、72h)的变化。 2．WboA-S2 菌株刺激的 BMDC 和 MΦ 提呈抗原作用 将感染 WboA-S2 菌株的 BMDC 和 MΦ 分别与 T 细胞共培养，并以 S2 菌株作为对照， 观察共培养后不同时间点(24h、48h、72h)细胞上清中 IFN-γ 和 IL-4 水平的变化，以明 确 WboA 基因编码产物在 BMDC 和 MΦ 提呈抗原、激活 T 细胞中的作用。 结果： 1. WboA-S2 菌株和 S2 菌株感染 MΦ 和 BMDC 后的形态学变化 瑞氏-吉姆萨染色光学显微镜下观察：感染后 1 h，MΦ 内空泡增多增大，胞质内可 见大量布鲁菌，WboA-S2 感染的 MΦ 细胞膜较 S2 株组完整；感染后 12 h，WboA-S2 和 S2 感染的 MΦ 胞质内仍见大量细菌，胞膜仍完整；感染后 24 h，S2 感染 MΦ 胞膜消失， 胞质脱落，核固缩，而相对 WboA-S2 感染后细胞膜较完整；而感染后 BMDC 的形态在 观察的时间内没有明显改变，在感染后 1h 细胞体积略增大，胞质内仅有少量细菌，细 胞较完整，至感染后 24 h 仅少量细胞膜破损。 2. WboA-S2 菌株 和 S2 菌株感染 MΦ 和 BMDC 吞噬率 S2 株感染后 1h，MΦ 的吞噬率为（43.6±4.8）%，显著高于 BMDC 的吞噬率（13.08±2.36） %（P0.05）；WboA-S2 菌株感染 MΦ 和 BMDC 后 1h 的吞噬率均高于 S2 感染的细胞 I II II （P0.05），提示 WboA-S2 菌株更易被 BMDC 和 MΦ 吞噬。 3. WboA-S2 菌株和 S2 菌株感染 MΦ 和 BMDC 不同时间点载菌量的变化 WboA-S2 菌株感染 1h，MΦ 和 BMDC 的载菌量均高于 S2 感染组，随着相互作用时 间的延长，各组细胞的载菌量均有所下降，至感染后 24h WboA-S2 菌株感染细胞的载菌 量则明显低于 S2 感染组（P 0.01），这表明：WboA-S2 菌株更容易被 MΦ 和 BMDC 杀 死和清除。 4. WboA-S2 菌株感染对 MΦ 和 BMDC 分泌 IL-12 和 TNF-α 的影响 MΦ组：与正常对照组比较，WboA-S2和S2菌株感染MΦ后各时间点培养上清中TNF-α 和IL-12均明显高于正常对照组（P0.01），说明布鲁菌WboA-S2、S2菌株可激活MΦ； WboA-S2菌株感染的MΦ分泌的TNF-α和IL-12明显高于S2感染组（P0.01），表明WboA-S2 菌株对MΦ的激活作用更强。 BMDC组：与正常对照组比较，WboA-S2、S2株感染BMDC后各时间点培养上清中 TNF-α和IL-12均明显高于正常对照组（P0.01），且WboA-S2菌株感染组的TNF-α和IL-12 明显高于S2感染组（P0.05），说明布鲁菌WboA-S2株和S2株同样均可激活BMDC；而且 BMDC对WboA-S2菌株刺激作用较布鲁菌S2株的刺激作用更强。 5. WboA-S2菌株和S2菌株感染MΦ和BMDC凋亡率的检测 WboA-S2 和 S2 感染对照：结果表明 WboA-S2 在感染后 24h MΦ 的凋亡率明显高于 S2 感染组和正常对照组的凋亡率（P0.05），而 WboA-S2 株和 S2 株感染后 BMDC 的凋亡与 正常对照组之间没有统计学意义。这提示 BMDC 是 S2 株布鲁菌的强大捕获细胞。 6. WboA-S2和S2菌株感染后MΦ与T细胞共培养上清中IFN-γ分泌 与正常对照组相比，S2、WboA-S2菌株感染MΦ后能刺激初始T细胞分泌IFN-γ高于 正常对照组（p0.05），而WboA-S