TaqMan探针荧光PCR法定量检测水中大肠埃希氏菌方法建立和应用-食品营养与卫生学专业论文.docxVIP

T TaqMan探 针荧光 PCR法定量检测水中大肠 埃希氏菌方法建立和应 用 摘要 Ta TaqMan 探针荧光 PCR 法定量检测水中大肠埃希氏菌方法建立和应用 中文摘要 目的： 1． 应用 TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术(RT-qPCR)，建立大肠埃希氏菌的快速定 量检测方法。 2． 优化水中细菌富集和 DNA 提取方法，以便应用 RT-qPCR 方法的进行水中大肠 埃希氏菌的检测。 3． 采用 RT-qPCR 和多管发酵法同时检测实际水样，验证 RT-qPCR 方法的准确性。 方法： 1． 根据大肠埃希氏菌的 ydiJ 基因，设计引物和探针，并分析其特异性和灵敏性。 2． 将分离的目标片断与 T 载体连接重组，制备大肠埃希氏菌的质粒 DNA 标准品。 3． 优化 RT-qPCR 反应检测体系，建立标准曲线，并进行方法学评价。 4． 通过比较各种水中细菌富集和 DNA 提取的方法，确定最佳前处理方法组合。 5． 采用 RT-qPCR 检测 20 份水样，所得结果与多管发酵法比较，以验证所建立方 法的准确性。 结果： 1． 引物 ydiJ577 的特异性实验结果表明，所有的大肠埃希氏菌和志贺氏菌标准菌 株均为阳性,9 株其它非大肠埃希氏菌标准菌株均为阴性; 2． 制备大肠埃希氏菌的质粒 DNA 经测序比对，结果: Identities = 90/91 (99%), Gaps = 0/91 (0%)。，标准品纯度：O D260/ OD280 = 0.047/0.026= 1.81 3． 加标水源水经膜洗脱（L 型棒洗脱法），磁珠法提取 DNA，所建立的标准曲线 线性范围 2.3×100～2.3×106CFU/mL (R2 :0.996)、检测限可达到 2.3CFU/mL。 4． RT-qPCR 和多管发酵法检测实际水样所得结果具有相关性，r=0.991, P0.01 结论： 1． RT-qPCR 方法有很好的特异性，能够快速、准确地检测水中大肠埃希氏菌。 2． RT-qPCR 方法特别适合在中高程度污染的水样中定量检测大肠埃希氏菌。 3． RT-qPCR 法可以作为现行标准方法的补充，能够更加准确、及时地评价水体受 粪便污染程度。 关键词：水；大肠埃希氏菌；PCR；定量检测 研究生：胡朝友 导 师：傅春玲 Development of a Real-Time qPCR Method (TaqMan probe based) for Detection and Enumeration of Escherichia coli in Water Abstract Objectives： 1． To develop a Real- Time qPCR Method (TaqMan probe) for Detection and Enumeration of Escherichia coli． 2． To find a optimized combinatorial method, which was sensitive, accurate and rapid for Escherichia coli concentration and DNA extraction, so that we can apply Real-Time qPCR method in Water. 3． To comfirm the accuracy of Real-Time qPCR Method, the result both of PCR and of conventional culture for natural water samples were compared and statistically analyzed. Methods： 1． Specific primers and probe were designed according to targeting the ydiJ gene of Escherichia coli. The primer taxonomic specificity and sensitivity were confirmed by polymerase chain reaction (PCR). 2． A Plasmid DNA Calibration standards containing a segment of the ydiJ gene were created by linking the PCR products and the T- vecter． 3． The reaction systems and conditions for P