Tie2基因RNAi慢病毒载体的构建及其干预恶性黑色素瘤细胞的体外研究-外科学(整形)专业论文.docxVIP

福建医科大学硕士研究生毕业论文 福建医科大学硕士研究生毕业论文 PAGE PAGE 10 Tie2 基因 RNAi 慢病毒载体的构建及其干预恶性黑色素瘤细胞的 体外研究 摘要 目的：构建和鉴定携带 Tie2-SiRNA 基因的慢病毒载体，利用 Tie2-SiRNA 慢病毒载体介导 RNA 干扰作用来沉默 Tie2 基因在恶性黑色素瘤细胞中的表达， 体外研究其对恶性黑色素瘤细胞中 Tie2 基因的抑制效率，为将来进一步进行裸 鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的体内抑制实验奠定基础，为肿瘤的基因治疗提供实 验依据。 方法： 1、首先利用限制性内切酶XbaⅠ将pSilencer1.0-U6-Tie2-siRNA重组质粒酶 切成所需的目的片段U6-Tie2-siRNA，电泳鉴定。 2、利用限制性内切酶XbaⅠ酶切空载质粒pNL-EGFP，电泳鉴定。 3、将经XbaⅠ酶酶切电泳鉴定的空载质粒与电泳鉴定正确的目的片段 U6-Tie2-siRNA以1:10浓度进行连接反应，构建pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ 慢病毒转移质粒，电泳挑选阳性单克隆，测序鉴定。 4、将连接成功的pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒转移质粒，分别与 包膜质粒pVSVG和包装质粒pHelper一起组成慢病毒三质粒转染系统[1、2]，按摩尔 浓度1:1:1的条件共转染293T细胞, 生产pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒。 5、将收集到的病毒上清液按不同的浓度感染293T细胞，测定所收集的病毒 原液的滴度。 6、将收集的病毒原液按不同的感染复数感染感染恶性黑色素瘤细胞，确定 合适的感染复数。 7、在合适的感染复数条件下，将收集到的慢病毒原液感染恶性黑色素瘤细 胞，通过实时荧光定量RT-PCR方法检测恶性黑色素瘤细胞中Tie2基因的表达量， 进而得到RNA干扰沉默Tie2基因表达的效率。 结果： 1、成功利用限制性内切酶 XbaⅠ从重组质粒 pSilencer 1.0-U6-Tie2-siRNA 中酶切出所需要的目的片段 U6-Tie2-siRNA。 2、成功构建慢病毒转移质粒 pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ，利用限制性 内切酶 XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定，结果正确。 3、成功使用三质粒慢病毒转染系统构建了 Tie2-SiRNA 慢病毒载体，293T 细胞测定病毒原液滴度为 8.8×103/ml。 4、感染复数为80条件下，慢病毒感染恶性黑色素瘤细胞的效率为94.5%， 实时荧光定量RT-PCR结果：Tie2-SiRNA慢病毒载体抑制了恶性黑色素瘤细胞中 Tie2基因的表达，其中较高者可达到68.55%（P0.05），同时两种慢病毒载体之 间的差异没有统计学的意义（P0.05）。 结论：成功使用三质粒转染系统构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,同时其能以 较高的感染效率在体外感染恶性黑色素瘤细胞，且能抑制恶性黑色素瘤细胞的 Tie2基因的表达，为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的体内抑制实验奠 定基础，提供实验依据。 关键词：受体，Tie2； RNAi； 慢病毒载体； 恶性黑色素瘤 Construction of recombinant lentiviral vector of Tie2-RNAi and the study of it,s intervention of malignant melanoma cells in vitro Abstract Objective： To construct and identify lentivector carrying Tie2-small interfering RNA(SiRNA) for studying the role of it,s intervention of malignant melanoma cells. The study will supply the theory basis to the further animal research on the inhibition of tumor growth in vivo and provide the experimental evidence for tumor gene therapy in future. Methods: 1、Using the restriction endonuclease XbaI to cut the recombinant plasmids of pSilencer1.0-U6-Tie2-siRNA for getting U6-Tie2-siRNA wich was identified by electrop