uPA和VEGF165单基因真核质粒共转染人脐静脉内皮细胞对细胞增殖的影响-外科学(血管外科)专业论文.docxVIP

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 目的： 构 建 尿 激 酶 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 (uPA) 和 人 血 管 内 皮 细 胞 生 长 因 子 165 （VEGF165）单基因真核表达质粒，并将 uPA 和 VEGF165 单基因真核表达质粒 共转染至人脐静脉内皮细胞（HUVECs），检测其转染后 uPA、VEGF165 的表达 及对细胞增殖的影响。 方法： 1. uPA和VEGF165单基因真核表达质粒的构建：设计带酶切位点的PCR引物 以及 合成引物；常 规培养 HUVECs，提 取RNA逆转 录成cDNA ；通过 PCR对 VEGF165及uPA基因片段扩增并引入新的酶切位点；将其分别定向连入真核表达 载体pIRES2-EGFP，构建表达目的基因的单顺反子，并转化至感受态细胞。通过 PCR 、 酶 切 分 析 及 DNA 序 列 测 定 鉴 定 重 组 质 粒 pIRES2/EGFP-VEGF165 和 pIRES2/EGFP-uPA。 2.重组质粒扩增后经脂质体介导体外转染人脐静脉内皮细胞，分组为A组 (PBS空白对照)、B（空载质粒pIRES2/EGFP转染阴性对照）、C（pIRES2/EGFP- uPA + pIRES2/EGFP共转染）、D组（pIRES2/EGFP-VEGF165 + pIRES2/EGFP共 转染）、E组（pIRES2/EGFP-VEGF165+ pIRES2/EGFP-uPA共转染）。通过MTT 比色法检测各组细胞转染后增殖能力，描画细胞生长曲线，实时荧光定量PCR （QPCR）检测各组细胞uPA及VEGF165 mRNA相对含量，Western blot检测uPA 及VEGF165的蛋白表达。 结果： pIRES2/EGFP-uPA和鉴定pIRES2/EGFP-VEGF165：重组质粒作XhoI 和 SalI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳可见VEGF165条带和uPA条带，酶切条带与聚合 酶链反应产物电泳带处于相同位置。DNA 序列测定证实，目的基因插入片段方 向正确，序列无突变。 转染pIRES2/EGFP-uPA和pIRES2/EGFP-VEGF165，MTT检测结果提示E II 组细胞增殖速率高于较A、C、B组，差异有显著性（P0.05）; E组与D组比较， 差异无显著性（P0.05）。QPCR提示E组uPA 基因相对表达量高于A、B、D组， 差异有显著性（P0.05）;E组与C组比较，差异无显著性（P0.05）；E组VEGF165 基因相对表达量高于较A、B、C组，差异有显著性（P0.05）；E组与D组比较， 差异无显著性（P0.05）。Western blot检测表明C、E组uPA蛋白表达量高于A、 B、D组，C、E组之间uPA蛋白表达未见明显差异，D组uPA蛋白表达量高于A、 B组，A、B组表达少量uPA；D、E组VEGF165蛋白表达量高于A、B、C组。 结论： 1.uPA 和 VEGF165 单基因真核表达质粒共转染人脐静脉内皮细胞后目的基 因 uPA 和 VEGF165 有效表达，细胞增殖速率明显加强； 2.在细胞内上调 VEGF165 能促进 uPA 的表达； 3.本实验为转染 VEGF165 和 uPA 治疗静脉血栓性疾病的基因研究奠定前期 理论基础。 关键词：血管内皮生长因子；尿激酶型纤溶酶原激活物；细胞增殖。 III Abs Abstract ABSTRACT Objective: To construct urokinase-type plasminogen activator (uPA) and human vascular endothelial growth factor 165 (VEGF165) single gene eukaryotic expression plasmid , and then they were co-transfected into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), to detect uPA, VEGF165 expression and proliferation of HUVECs after transfection. Methods: Construction of uPA gene and VEGF165 single gene eukaryotic plasmid: Design and synthesize primers with restriction sites , introduce new restriction sites to VEGF and uPA gene, which were directed to connect