沉默miR156表达mimicry156载体构建及转化烟草研究.docVIP

沉默miR156表达mimicry156载体构建及转化烟草研究 　　摘要：miR156在植物营养生长阶段幼年期向成年期的转变过程中发挥重要的调控作用，其通过降解SPLs基因mRNA和翻译抑制调控靶基因的表达。通过定向改造拟南芥内源性Target mimicry IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1）构建了抑制miR156表达的mimicry156载体，并转化获得转基因烟草植株，转基因植株mimicry156对内源性miR156具有抑制作用。该方法为研究miR156在植物营养生长阶段的调控作用提供了方便有效的途径。 　　关键词：miR156；Target mimicry IPS1；表达载体；转化 　　中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0210-05 　　miRNA是真核生物中非编码的小RNA，在基因转录后的调控过程中发挥重要作用，一般位于编码蛋白质的基因之间，在高等植物编码蛋白质基因的转录产物中存在茎环（Stem-Loop）结构，经过一系列复杂的加工后，Dicer-Like（DCL）家族基因将茎环结构中大约21个核苷酸大小的成熟miRNA单链切割出来，其可以选择性地装载到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）上，miRNA与靶标RNA进行互补配对，造成靶标RNA的降解或翻译抑制[1]，因而能在转录后水平专一性调控靶基因的表达。通常miRNA与其靶基因之间的表达呈负相关，即在组织水平上某个miRNA含量的增加往往伴随着其靶基因转录水平的下降，与转录抑制因子相比，miRNA能在转录后水平更迅速地调节靶蛋白质含量，显著缩短调控反应的延滞期，精确维持靶蛋白质的稳定状态，从而有效地调控植物的生长发育[2]、生物及非生物的胁迫响应[3]。 　　miR156在植物营养生长阶段幼年期向成年期转变过程中发挥重要的调控作用，其在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[4]，玉米（Zea mays）[5]，苔藓（Physcomitrella patens）[6]、番茄（Lycopersicon esculentum）[7]，夏堇（Torenia fournieri）[8]、软枝草（Panicum virgatum L.）[9]、水稻（Oryza sativa）[10]等植物中都被证明是营养期转化的关键调控因子。miR156通过降解SPLs基因mRNA并通过翻译抑制调控靶基因表达，miR156的表达丰度随着植物发育进程逐渐降低的同时，解除了对SPLs基因的抑制从而顺利调控植物幼年向成年的过渡。 　　miR156等microRNA在植物中的重要调节作用已成为近年来研究的热点。正向遗传学研究法通过诱变剂处理，大量筛选突变体研究其表型和生理代谢。但是这种方法随机性较大，不易获得目的miRNA功能缺失的突变体，给研究带来了较大的障碍。靶基因模拟（Target mimicry，TM）技术的出现提供了一种新颖的miRNA研究方法。 　　植物中磷的生理平衡受复杂的调控系统支配，从而有效地控制植物的生长[11]。研究发现miR399、PHO2和IPS1形成反馈循环系统调节植物中磷的动态平衡。在缺磷胁迫下miR399诱导降解与其具有一段互补区域的PHO2 mRNA，PHO2能够编码一种E2泛素结合酶，而这种酶影响植物中磷的含量和再利用过程[12]。除了PHO2 mRNA能够与miR399互补结合外，研究发现TPSI基因家族的mRNA同样含有miR399的结合域，IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1）属于TPSI家族的一员，但与miR399互补配对的IPS1不仅没有降解反而具有抑制miR399活动的效果[12]。与miR399调节PHO2的靶位点相比，IPS1在结合域的中心位点有3个核苷酸的插入，相当于miRNA调节靶基因结合区域的突起部分，从而阻止了miR399-RISC复合体对IPS1的切割，同时IPS1占据miR399，从而抑制其对靶基因的降解作用[13]。研究发现，IPS1作用原理同样可用于抑制其他miRNA的活动[13]，本研究通过定向改造拟南芥内源性IPS1构建抑制miR156表达的mimicry156载体，旨在为进一步研究miR156在植物营养阶段的调控作用打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　1.1.1 材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Col-0），烟草（Nicotiana tabacum）（NC89）均为浙江农林大学蔬菜品质改良重点实验室保存。 　　1.1.2 细菌菌株与质粒