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泸宁鸡MyoD基因克隆及生物信息学分析 　　摘要：为了研究MyoD基因在鸡生长发育与肉质形成中的作用，以泸宁鸡为研究对象，采用RT-PCR技术克隆MyoD基因序列，并利用生物信息学的方法，对其氨基酸同源性、理化性质等进行分析和预测。结果表明：泸宁鸡MyoD基因序列长度为988 bp，其编码的蛋白含299个氨基酸残基，具有碱性螺旋-环-螺旋结构（bHLH）；根据MyoD基因比对，构建的进化树显示泸宁鸡与人等哺乳动物的同源性为63%～67%，与原鸡、绿头鸭、游隼的同源性为94%～99%。 　　关键词：MyoD基因；基因克隆；泸宁鸡；生物信息学 　　中图分类号： S831.2 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）09-0053-05 　　自Davis等首次对人类生肌决定因子（myogenic determining factor，MyoD）进行克隆以来，生物学家对该基因的结构特征及生物学功能产生了浓厚兴趣[1]；MyoD在肌肉生成早期分化过程中和成肌细胞增殖阶段进行表达，主要参与生肌过程[2]，具有决定肌卫星细胞能否成为肌肉干细胞的功能，并控制着整个肌肉的发育过程[3-5]，属于初级生肌调节因子（MRFs）。由于MyoD基因产物在多种分化细胞向肌细胞转化的过程中扮演了重要角色，因此，近年来在动物肉质改良育种工作中，对该基因的研究成为热点。对于成年动物而言，MyoD基因可以调节控制肌细胞的增殖、分化和肌肉组织的增生[6]。Akizawa等学者研究表明，MyoD可与肌球蛋白、肌细胞生成素及肌酸激酶CK等基因的启动子区结合，正调控骨骼肌的生长发育[7-8]。Liu在研究火鸡胚胎发育时发现，随着火鸡的胚胎发育，MyoD的mRNA表达量呈显著下降趋势[9]。Gayraud-Morel等学者指出了，MyoD和Myf5表达量在成年动物的骨骼肌发育有关[6]。国外学者Powell等、国内学者李娟等研究发现，营养状况对动物肌卫星细胞的分裂活性以及肌肉发育有重要影响，并且赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸及亮氨酸的浓度与MyoD蛋白表达水平有着正相关关系[10-16]，以上均表明MyoD在动物肌肉生长中具有不可或缺的调控作用。 　　基于上述研究，对MyoD的功能研究显得尤为重要，但目前研究多集中于猪、牛、山羊等动物[17-21]，而关于禽类MyoD基因特征研究报道相对较少，并尚未见在泸宁鸡的研究中报道。泸宁鸡作为四川凉山州肉蛋兼用型的优质地方养殖鸡种，胸腿肌占胴体质量比例较大，耐粗饲，抗病力强，是一个有发展前途的地方良种鸡[22]。因此，本研究以泸宁鸡为研究对象，通过克隆MyoD基因，并分析其基因及编码蛋白特征，探讨MyoD基因在泸宁鸡生长、发育过程中的作用具有实际的理论和应用价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验动物及试剂 　　试验用的泸宁鸡采自四川省凉山州冕宁县原生农业有限公司，屠宰后迅速采其肌肉组织样品置于液氮中以备用；主要试剂为：Taq酶及DH5α感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司产品]，转化载体pMD19-T及反转录试剂盒（大连TaKaRa），Trizol试剂（Invitrogen公司），胶回收试剂盒（博大泰克生物技术有限公司）。 　　1.2 MyoD基因引物的设计与合成 　　依据原鸡的MyoD基因序列（GenBank中登录号为NP_989545.2）设计扩增ORF的上、下游引物（设计软件为Premier 5.0）[PF（上游），5′-ACCGCCATCTCACCCCACTC-3′；PR（下游），5′-TGGCTGAACGGAGCAATTTGTT-3′]，送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　1.3 泸宁鸡MyoD基因克隆 　　泸宁鸡肌肉组织样中的总RNA提取办法参考梅寒等在泸宁鸡MyoG基因克隆中的办法[23]。经分光光度仪检测，将质量符合要求的泸宁鸡总RNA进行反转录，得到的产物进行PCR扩增，25 μL反应体系包括：PF和PR各1 μL，cDNA1 μL，9.5 μL灭菌去离子水，最后加Taq酶12.5 μL。其反应条件分别为：在94 ℃温度下预变性5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 35个循环；72 ℃延伸5 min。胶回收，凝胶电泳检测得到目的条带产物，连接于pMD-19T载体（温度为16 ℃，时间为45 min），转入感受态细胞（DH5α），提取经筛选得到阳性克隆质粒，送Invitrogen公司测序。 　　1.4 泸宁鸡MyoD基因氨基酸残基序列分析 　　克隆测序所得的MyoD序列经软件拼接并翻译成相应氨基酸序列（DNAman软件），并利用该软件对比分析泸宁鸡与其他物种之间的同源关系，制作进化树。利用上述翻译得到的蛋白质氨基酸残基