小肽氨基酸组成对体外培养奶牛乳腺组织乳蛋白合成影响.docVIP

小肽氨基酸组成对体外培养奶牛乳腺组织乳蛋白合成影响 　　摘要：为研究不同二肽对奶牛乳腺组织中乳蛋白合成的影响，在体外培养的奶牛乳腺组织培养液中分别添加不同的赖氨酸二肽：赖氨酸-赖氨酸（Lys-Lys）、赖氨酸-组氨酸（Lys-His）、赖氨酸-苯丙氨酸（Lys-Phe）、赖氨酸-亮氨酸（Lys-Leu）和赖氨酸-苏氨酸（Lys-Thr），等量取代培养液中10%游离赖氨酸（赖氨酸总浓度为210 μg/mL）进行培养，试验结束后收集乳腺组织和培养液分别检测基因表达和乳蛋白合成。结果表明，同游离Lys和Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His二肽相比，Lys-Leu和Lys-Phe显著提高了乳腺组织中αs1酪蛋白基因的表达（P0.05）；5种肽结合Lys均显著提高了小肽转运载体2（PepT2）的mRNA丰度（P0.05），Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促进PepT2基因的表达（P0.05）。说明小肽不同的氨基酸组成可影响奶牛小肽的摄取和乳蛋白的合成，同亲水性氨基酸组成的小肽相比，疏水性氨基酸组成的小肽更能促进乳腺αs1酪蛋白基因的表达。 　　关键词：小肽；氨基酸；赖氨酸二肽；乳蛋白；小肽转运载体2；奶牛乳腺组织；丰度；αs1酪蛋白基因 　　中图分类号： S823.9+11 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0166-02 　　收稿日期：2016-04-29 　　基金项目：山东省潍坊市科技发展计划（编号：2015GX077）。 　　作者简介：周苗苗（1983―），女，山东聊城人，博士，副教授，主要从事反刍动物泌乳生理研究。E-mail：zhoumm0329@163.com。 乳腺组织能摄取血液循环中的小肽（2～3个氨基酸组成）作为乳蛋白合成的前体物质，小肽在反刍动物乳腺蛋白合成中发挥重要作用[1-2]。很多研究证实，给体外培养的奶牛乳腺上皮细胞培养液中添加适当浓度的必需氨基酸如蛋氨酸（methionine，Met）、赖氨酸（lysine，Lys）、缬氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、苏氨酸（threonine，Thr），小肽均能促进酪蛋白的基因表达和乳蛋白合成[3-9]。目前关于小肽添加量对乳蛋白合成的影响研究较多，而小肽的氨基酸组成对乳蛋白合成影响的研究较少。因此，本试验初步探讨了不同氨基酸组成的含Lys二肽对体外培养的奶牛乳腺组织乳蛋白合成的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 奶牛乳腺组织体外培养 　　取泌乳中期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。将组织块种植于6孔板上，置于二氧化碳培养箱中（37 ℃，5%CO2），待组织贴壁后每孔添加2 mL培养液。培养液成分为基础培养液DMEM（dulbeccos modified eagles medium）-F12（Gibco，美国）添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、5 μg/mL 胰岛素（Sigma，美国）、500 ng/mL催乳素（Sigma，美国）、1 μg/mL氢化可的松（Sigma，美国）以及10%胎牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）。 　　1.2 试验设计 　　试验处理培养液中去除胎牛血清、补充几种必需氨基酸[Phe、Met、Lys、Leu、Val、异亮氨酸（isoleucine，Ile）、苏氨酸（threonine，Thr）、组氨酸（histidine，His）]，并按试验设计调整相应氨基酸和小肽的浓度。分别用培养液中Lys总量（210 μg/mL）10%肽结合Lys[Lys-Lys/（LL）、Lys-His/（LH）、Lys-Phe/（LP）、Lys-Leu/（LU）、Lys-Thr/LT]替代等量的Lys。试验处理48 h后，分别收集乳腺组织和培养液用于总RNA提取和总蛋白含量测定。每个处理重复3次。 　　1.3 RNA提取和cDNA合成 　　用Trizol（Invitrogen，美国）提取组织中的总RNA。RNA纯度以紫外吸光法检测（D260 nm/D280 nm1.80）。抽提的RNA溶解后立即用于第1链cDNA的合成（PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒，TaKaRa）。合成的cDNA贮存于-20 ℃，备用。 　　1.4 实时荧光定量PCR（real-time PCR） 　　采用实时荧光定量PCR方法检测mRNA的表达。αs1酪蛋白、小肽转运载体2（oligopeptide transporter 2，PepT2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的