山桃醇腈酶基因PdHNL1克隆序列分析与原核表达.docVIP

山桃醇腈酶基因PdHNL1克隆序列分析与原核表达 　　摘要：以山桃叶片为材料提取RNA，反转录后得到cDNA，通过PCR扩增得到1个山桃醇腈酶基因全长编码序列，并命名为[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]。[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的开放阅读框为1 737 bp，预测编码蛋白包含539个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明，[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]编码的蛋白具有葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶的序列特征，与黑樱桃醇腈酶PsHNL4蛋白相似度为92%，与桃假定的HNL蛋白相似度为77%。通过将[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因连接到原核表达载体pET28（a）上，并转化大肠杆菌BL21 （DE3）后，成功构建了原核表达重组菌株。SDS电泳结果显示，重组蛋白受IPTG诱导表达，分子量大小约为62.4 ku，与已报道的其他蔷薇科植物的醇腈酶蛋白大小基本一致。 　　关键词：山桃；醇腈酶；基因克隆；原核表达 　　中图分类号：S662.101；Q786 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0020-05 　　利用酶作为催化剂用于合成单一对映体或直接分离特定手性异构体，被广泛应用于不对称合成领域。醇腈酶作为一种不对称催化手性反应的酶，自20世纪初在扁桃中发现以来，受到愈来愈多的关注[1]。它可逆地催化HCN和醛/酮类化合物反应生成手性氰醇[2]，进而转化成为羟基化合物等多种手性中间体，并用于合成多种手性药物，从而克服了为得到纯手性化合物而采用光学拆分所带来的生产工序复杂、成本高等一系列问题[3-4]。此外，在植物体内，醇腈酶可催化氰基糖苷类化合物，反应生成羰基化合物和HCN，而后者在植物防御草食类动物摄食或其他致病菌感染中起到作用，即植物的生氰作用[5-6]。 　　HNL在自然界中是广泛存在的。据统计，有3 000～12 000 种植物内含有HNL。HNL主要分为两大类：R构型和S构型。目前，已分离纯化并进行酶活分析的R型HNL多来自于蔷薇科植物[7]，如扁桃、黑樱桃、梅、枇杷、西番莲等[8-13]；而S型HNL多来自于木薯、橡胶树、海檀木与高粱[14-17]。笔者所在研究组根据前期公布的桃的基因组数据[18]，通过序列同源比对分析，发现其中有3条序列为编码推测的HNL蛋白。此外，山桃、桃与扁桃同属于蔷薇科桃属，目前有关山桃中HNL的研究并未报道。因此，本研究采用生物信息学结合PCR的方法，克隆得到1个山桃HNL基因，并对其进行了相关的生物信息学分析与原核表达研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　山桃[Prunus davidiana （Carr.） C.]叶片取自江苏省中国科学院植物研究所，采集后迅速放入液氮中冷冻，于 -80 ℃ 保存备用。 　　高纯总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，表达载体pET28（a）购自Novagen公司，rTaq DNA聚合酶、克隆载体pMD19-T、Oligo （dT）18、DNA Markers、限制性内切酶和反转录酶M-MLV （RNase H―）等购自大连宝生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；其他化学试剂均为国产分析纯。大肠杆菌DH5α、TOP10和BL21 （DE3）菌株为笔者所在实验室保存，引物合成和测序工作分别委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司与上海美吉生物医药科技有限公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 总RNA提取及cDNA的合成 按照高纯总RNA快速提取试剂盒的操作说明，提取山桃叶片的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度与完整性，并以此为模板，根据TaKaRa公司的反转录试剂盒说明书反转录得到山桃cDNA。 　　1.2.2 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的克隆及生物信息学分析 根据桃基因组测序组公布的序列，通过比对搜索出编码假定醇腈酶蛋白的基因序列，并根据这些序列设计特异引物，上游引物为 F0：5′-ATGGTGAAATCAACAATGTC-3′，下游引物为 R0：5′-AGTATCAAACGCAAAGGAT-3′。以反转录得到的 cDNA 为模板进行 PCR扩增，扩增反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，纯化后的产物连接到 pMD19T载体上，转入大肠杆菌 DH5α感受态细胞，挑取克隆进行PCR与质粒酶切检测，鉴定结果均为阳性的重组子送交公司测序。 　　测序结果通过NCB