应用MTD试剂盒对HIVAIDS患者结核分枝杆菌复合群进行快速检测临床应用价值探讨.docVIP

应用MTD试剂盒对HIVAIDS患者结核分枝杆菌复合群进行快速检测临床应用价值探讨 　　【中图分类号】R183.3 【文献标识码】B 【文章编号】1672-3783（2012）10-0318-02 　　【摘要】目的 比较和评价结核分枝杆菌直接检测（MTD）方法在AIDS合并疑似结核感染试验组和非AIDS的结核待排对照组中的应用，同时与涂片抗酸染色、BacT/ALERT 3D 360 MP结核分枝杆菌快速培养联合TB-DNA PCR方法进行比较。方法 采用MTD、直接涂片镜检、结核培养联合TB-DNA PCR 3种方法，平行检测127例AIDS试验组和25例TB对照组患者的肺部样本。结果MTD法检测阳性 AIDS试验组29.13%（48/127）、对照组44.00%（11/25），经卡方检验差异有统计学意义（X2=7，P0.05）。结论 MTD快速检测实验是一项新的生物学检测技术，具有快速、灵敏的特点，值得在AIDS…临床推广。 　　【关键词】结核分枝杆菌（MTB）；结核分枝杆菌快速检测（MTD）；转录主导扩增法（TMA）；杂交保护分析法（HPA） 　　传统的结核病实验室诊断技术有直接涂片抗酸染色镜检、结核分枝杆菌培养和TB-DNA PCR检测3种方法。由于涂片法阳性检出率偏低，且不能作死活菌鉴别，培养法需时较久，TB-DNA PCR在应用于阳性培养物方面阳性检出率较高，而在血液、痰液、灌洗液等原始样本的阳性检出率偏低。为满足临床迫切需要一种更快速、更准确的早期诊断结核病的方法，以保证及早的、更合理地进行治疗，我们引进了美国Gen-Probe公司rRNA扩增结核分枝杆菌直接检测（MTD）1技术应用于临床，并与传统的涂片抗酸染色和BacT/ALERT 3D 360 MP结核分枝杆菌培养法联合TB-DNA PCR进行平行观察，以比较其优劣，从而探讨该法的临床应用价值。 　　1 材料和方法 　　1.1 样本来源及分组：痰、灌洗液、术后痰等肺部临床标本，主要来源于本院住院部感染一、二、三科、内科。对资料齐全的152例疑似结核患者进行分析，其中AIDS试验组127例，TB对照组25例，均有不同程度的发热、咳嗽、咳痰、头痛、呼吸困难等疑似结核症状。 　　1.2 主要仪器及试剂：水浴超声仪、95℃干浴仪、42℃干浴仪、60℃干浴仪及LEADER 50i化学发光检测仪等，均为美国Gen-Probe公司商品。MTD试剂盒、检测试剂和阴、阳性质控物等，均为美国Gen-Probe公司商品。 　　1.3 MTD操作方法：严格按照MTD试剂盒说明书的要求进行操作，其主要反应步骤如下：（1）前处理：痰液、灌洗液、术后痰等标本10ml加入到50ml尖底塑料离心管内，加入等体积的N-乙酰-半胱氨酸-氢氧化钠溶液（NALC-NaOH溶液——4%NaOH：柠檬酸钠.2H2O：NALC=15ml：15ml：0.15g），旋紧盖子，用振荡器振荡充分混匀至标本液化为止（约5-20秒/管），颠倒混匀离心管，室温静置15min除菌，用无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）将已消化除菌的标本稀释至离心管50ml刻度，盖紧盖子，漩涡振荡或颠倒混匀，3000g离心15min，将上清液倒入盛有消毒剂的容器内，在沉淀物中加入1-2ml的牛白蛋白溶液混匀待用。（2）裂解细菌释放rRNA ：吸取50ul标本稀释缓冲液（SDB）加入到裂解试管中，将450ul经过前消化处理并充分振荡的标本、阳性、阴性质控物加至相应的裂解试管中，加样完毕后重新盖好试管，漩涡振荡3秒钟，于水浴超声仪中振荡15～20min。（3）溶解产物：标本裂解物、阳性、阴性质控物各25ul（用加长的带过滤塞加样枪头）分别加入预置有50ul扩增试剂及200ul甘油的扩增管底部，于95℃干浴仪中孵育15～20min。（4）扩增：各扩增管在42℃干浴仪中冷却5min后，加入25ul复溶好的酶试剂混匀后继续在42℃干浴仪中孵育30～60min。（5）杂交：各管中加入100ul溶解后的杂交试剂混匀后于60℃干浴仪中孵育15～20min。（6）筛选：各管中加入300ul筛选试剂混匀后于60℃干浴仪中孵育15～16min，取出置室温5min后在1小时内检测。（7）检测：用LEADER 50i化学发光检测仪检测样品吸光值（RLU），样品被检测的同时rRNA也被淬灭。（8）结果判断：RLU≥500000阳性，RLU30000阴性，30000～499999RLU可能为结核分枝杆菌复合群，重复试验以验证结果（重复试验RLU≥30000即可判为阳性）。要求同批检测的阳性质控RLU≥1000000，阴性质控RLU20000，方可报告。 　　1.4 其它平行检测方法：每份样品的前处理沉淀物均以常规方法平行作涂片抗酸染色、BacT/ALERT 3D 360