异育银鲫中科3号MSTN基因克隆与序列分析.docVIP

异育银鲫中科3号MSTN基因克隆与序列分析 　　摘要：采用同源克隆和末端快速扩增（rapidamplicationofcDNAends，RACE）方法分离克隆了异育银鲫（Allogyogeneticscruciancarp）中科3号肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因全长DNA，得到3394bp全长的DNA，包含3段外显子和2段内含子，其中2098bp的全长cDNA在NCBI数据库中进行序列比对后，确定为异育银鲫中科3号MSTN基因。对推测的MSTN基因氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：MSTN基因在异育银鲫与斑马鱼及其他鱼类间的氨基酸序列相似度为73.5%～98.0%，与鲤鱼MSTN基因相似度最高（98.0%），不同物种间MSTN的氨基酸序列较为保守。用半定量RT-PCR检测MSTN基因在异育银鲫心、肠、肌、脑、鳃和肝的相对表达量结果表明，MSTN基因在脑中含量最高，其次是肌、鳃、心、肠，在肝脏中含量最低。 　　关键词：异育银鲫；肌肉生长抑制素；同源法克隆；末端快速扩增法；序列分析；组织表达分析 　　中图分类号：S917.4；Q785文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0040-05 　　鲫鱼是我国重要的淡水经济养殖鱼类，异育银鲫（Allogyogeneticscruciancarp）中科3号是当前主要的鲫鱼养殖品种之一。该品种是中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室桂建芳研究员等技术人员利用银鲫的双重生殖方式，从高体型（D系）异育银鲫（♀）与平背型（A系）异育银鲫（♂）交配所产后代中选育出来，再经异精雌核培育而来的异育银鲫第3代新品种[1]。中科3号异育银鲫具有生长速度快、遗传性状稳定等优点[2-4]，作为经济鱼类，其肌肉的生长发育是重要的生长过程，受分子水平调控等多因素的影响[5]。 　　肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）又称生长分化因子-8（growthdifferentiationfactor-8，GDF-8），属于转化生长因子-β（transfominggrowthfactor-β，TGF-β）超家族，是肌肉发育和生长的负调控因子[6]。该基因是McPherron等于1997年在小鼠骨骼肌的cDNA文库中发现的，试验表明，MSTN基因敲除后的小鼠会发生肌细胞的增生与肥大，从而导致骨骼肌大量增加的现象[6]；牛中MSTN基因的自然缺失与突变也已被发现，突变结果导致MSTN基因失活，肌肉增生[7-8]。 　　目前，已有不少关于MSTN基因克隆及作用机制的研究，包括哺乳类[9-11]、鸟类[12-14]动物，在鱼类的研究中，也有不少物种的MSTN基因被报道，包括斑马鱼（Daniorerio）[8，15]、虹鳟（Oncorhychusmykiss）[16]、大麻哈鱼（Salmosalar）[17]、莫桑比克罗非鱼（Oreochromismossambicus）[18]、斑点叉尾（Ictaluruspunctatus）[19]、石首鱼（Umbrinacirrosa）[20]、奥利亚罗非鱼（Oreochromisaureus）[21]、?鱼（Elopichthysbambusa）[22]、军曹鱼（Rachycentroncanadum）[23]、牙鲆（Paralichthysolivaceus）[24]、勒氏笛鲷（Lutjanusrussellii）[25]、黄颡鱼（Pelteobagrusefulvidraco）[26]、泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）[27]、真鲷（Chrysophrysmajor）[28]、鳙鱼（Aristichthysnobilis）[29]等。鱼类MSTN基因除在骨骼肌中表达外，还可在其他组织如脑、心脏、肾、肠、精巢、鳃、脾、眼、肝等中表达[22，30]，不同于哺乳动物和鸟类的表达谱[31-32]。试验表明，MSTN基因功能缺失可以导致斑马鱼肌肉数量和体积的增加[15]。MSTN通过内分泌、自分泌和旁分泌3种不同的作用途径发挥作用，可与成肌细胞膜上的受体结合而引起受体自身的磷酸化，启动一系列信号传导过程，最终抑制成肌细胞的增殖和分化[33]。MSTN作为肌肉生长发育相关的重要调控基因，其相关研究对了解鱼类肌肉生长机理有重要作用。本试验克隆了异育银鲫MSTN基因，并对其序列和组织表达进行了分析。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　试验用异育银鲫中科3号质量约80g，购自扬州市江都区，取20尾于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心（江苏无锡）的育种实验室进行暂养，用于RNA及DNA的提取。基因提取、反转录等试剂盒均购自TaKaRa公司（大连）。 　　1.2试验方法 　　1.