沉默tak1表达对三氧化二砷作用kasumi-1细胞凋亡的研究-effects of silencing tak 1 expression on kasumi - 1 cell apoptosis induced by arsenic trioxide.docxVIP

摘 要 第一部分 CCK-8 法检测 As2O3 作用 kasumi-1 细胞株细胞增殖情况 目的：筛选出作用于 kasumi-1 细胞株的最佳 As2O3 浓度，为后期实验的药物作用浓 度提供依据。 方法：采用浓度为 0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、 20μmol/L 的 As2O3 分别作用于 Kasumi-1 细胞 0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h。CCK-8 法检测 As2O3 作用 kasumi-1 细胞后细胞的增殖情况，绘制药物作用后细胞的生长曲线， 计算药物作用的 IC50 值。 结果：As2O3 作用后，细胞增殖抑制率呈浓度依赖性，和时间相关性不大，IC50 值 为 3.5μmol/L。 结论：后期实验选择 As2O3 作用浓度为 2μmol/L。 第二部分 脂质体介导法转染 kasumi-1 细胞株转染条件的优化及 siRNA 筛选 目的：筛选沉默效果最佳的 siRNA。 方法：以 TAK1 作为靶基因，设计出 4 条 siRNA 序列，从有无血清、转染时间、 脂质体剂量、siRNA 剂量四个方面优化转染效率。采用实时定量 PCR 和 Western Blot 的方法检测 siRNA 作用后，TAK1 基因在 mRNA 和蛋白质水平上的变化。 结果：TAK1siRNA转染kasumi-1细胞在无血清和有血清时比较，转染效率分别为 (75.48±1.07）%和(61.66±0.74）%，P=0.000，差异有统计学意义；siRNA剂量为20pmol， Lipofectamine2000为1.0ul下，转染时间分别为1h、2h、4h、6h、8h、12h时，转染效率 分别为（28.37±1.01）%、（47.71±0.93）%、（45.42±1.26）%、（51.68±1.28）%、（52.42±0.91）%、 （33.31±1.25）%，6h和8h时，转染效率比较P=0.433，差异无统计学意义。其余各组之 间P＜0.007，差异有统计学意义；PCR及Western Blot结果显示：siRNA3作用组，TAK1 在mRNA和蛋白表达上最低。 结论：在无血清、转染6或8小时、脂质体剂量/siRNA为20pmol/1μl时，转染效率最 I PAGE PAGE VI III III 高。siRNA3沉默效果最佳。 第三部分 封闭 TAK1 基因对加强三氧化二砷促 kasumi-1 细胞凋亡的实 验研究 目的：沉默TAK1表达对As2O3作用Kasumi-1细胞凋亡机制的研究 方法：实验分4组，未处理组、TAK1siRNA转染组、As2O3处理组、TAK1siRNA转 染联合As2O3组，流式细胞学检测细胞凋亡率，甲基纤维素半固体培养计算克隆形成率， Western Blot检测下游蛋白表达量。 结果：As2O3 作用 kasumi-1 细胞后，P-JNK 表达增强，在 As2O3 浓度为 2μmol/L， 作用 30min 时，P-JNK 表达最强。kasumi-1 细胞、TAK1siRNA 转染、As2O3 作用、 TAK1siRNA 联合 As2O3 作用后，细胞凋亡率分别为（5.02±1.13）%、（6.18±0.28）%， （48.33±2.70）%、（86.07±2.21）%，集落形成率分别为（73.83±2.78）%、（76.03±1.46）%、 （55.07±1.50）%、（22.20±1.15）%，不同处理条件下凋亡率比较，kasumi-1 细胞和 TAk1siRNA 作用比较 P=0.052，其余各组比较 P=0.000；不同处理条件下集落形成率比 较，kasumi-1 细胞和 TAk1siRNA 作用比较 P=0.179，其余各组比较 P=0.000。 结论：沉默 TAK1 表达显著增强 As2O3 对 Kasumi-1 细胞的促凋亡作用。通过对 MAPK 信号通路的研究，提示在 As2O3 作用 kasumi-1 细胞的机制中，TAK1 下游传导信号 JNK 为一负反馈传导途径。分子或药物性的靶向激酶在增强 As2O3 抗白血病作用上可能提供 一个新途径，为开展通用型靶向药物提供一个潜在的研究方向。 关键词： TAK1，siRNA 干扰，三氧化二砷，细胞凋亡 ABSTRACT part one Detecting kasumi-1 cells proliferation treated by As2O3 using CCK-8 Objective:This study aims to screen out the most optional concentration of As2O3 acted on