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拓扑替康治疗多发性骨髓瘤实验研究 　　[摘要] 目的 研究抗肿瘤植物药拓扑替康(TPT)对多发性骨髓瘤(MM)细胞株的作用,为其临床治疗MM提供实验依据。方法 应用MTT等方法,检测TPT对多发性骨髓瘤细胞株增殖、凋亡及周期的影响。结果 不同剂量TPT作用RPMI8226细胞48h,其半数抑制浓度为57ng/mL。不同浓度梯度TPT作用于RPMI8226细胞48h,其早期凋亡细胞百分数均分别高于空白对照组。TPT可使RPMI8226细胞阻滞于S期,减少或停止向G2/M期转化,表现为典型的细胞S期捕获。结论 (1)TPT可直接抑制MM细胞株的生长,并促进其凋亡,且呈时间和浓度依赖性。(2)TPT可阻滞大部MM细胞株于S期。 　　[关键词] 拓扑替康(TPT); 多发性骨髓瘤(MM); 细胞凋亡; 细胞周期 　　[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2009)27-21-02 　　 　　多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞克隆性增生的恶性血液病。近年来,对多发性骨髓瘤的治疗取得了较大进步。然而,获得完全缓解(CR)的患者仍不可避免地出现耐药和复发现象,特别是那些具有细胞遗传学异常(约1/3)的患者。该病的中位生存期为2～3年。因此,迫切需要新的药物。从天然植物中提取抗肿瘤药物既是当前中医药现代化的重要组成部分,也是国内外基础和临床医学研究的一个热点。自然界中可用于肿瘤治疗的植物药数量繁多,如能将其中起主要作用的有效成分提取分离出来并研究其理化性质及作用机制,对于研制开发抗肿瘤新药将具有非常重要的意义。既往的研究表明,TPT为拓扑异构酶I的抑制剂,是S期细胞周期特异性药物,具有很强的抗肿瘤活性和广泛的抗癌谱,有较强的诱导肿瘤细胞分化作用[1];近年来有报道TPT能通过多种途径诱导白血病细胞凋亡[2,3],且能影响细胞周期[4],表明TPT能通过多种信号途径抑制肿瘤细胞生长。TPT作用于MM的研究报道甚少,在该实验中,以MM细胞株RPMI8226为研究对象,从细胞抑制、细胞凋亡、细胞周期改变等多方面探讨TPT对MM细胞的影响及其作用机制。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株 人多发性骨髓瘤细胞株:RPMI8226。 　　1.1.2 主要实验仪器 细胞培养箱,显微镜,光学显微镜,酶标仪,流式细胞仪,紫外分光光度仪,低温离心机,-70℃冰箱,恒温混匀器,微量加样器,垂直电泳装置,转膜装置,超声波细胞粉碎机,超速台式离心机。 　　1.1.3 试剂和药品 拓扑替康,RPMI 1640培养基,胎牛血清,四甲基偶氮唑蓝,细胞凋亡检测试剂盒,PI试剂盒,75% 乙醇,甘氨酸,L-谷胺酰胺,Tris碱,二水乙二胺四乙酸二钠,分析纯等。 　　1.2 方法 　　 　　1.2.1 细胞培养 采用常规培养,人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226悬浮生长于含体积分数10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液中,在37℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度培养箱中培养,2～3d换液传代1次。取对数生长期细胞为实验对象。 　　1.2.2 细胞计数 细胞计数板计数,重复3次。 　　1.2.3 细胞增殖 MTT比色法检测细胞增殖。 　　1.2.4 细胞凋亡 流式细胞仪检测细胞凋亡。 　　1.3 统计学方法 　　常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差(χ±s)表示。多组资料之间的比较采用单因素方差分析;相关与回归分析;方差不齐者采用非参数检验。以P0.05为差异有统计学意义。采用SPSS12.0 for Windows统计处理软件分析。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 拓扑替康对MM细胞株生长的抑制作用 　　不同浓度(0～320ng/mL)TPT处理RPMI8226细胞48h,与空白对照组相比,对MM细胞有显著的抑制作用(P=0.001);经加权直线回归法计算,其在48h的半数抑制浓度(IC50)为57ng/mL。TPT对RPMI8226细胞的抑制作用具有剂量依赖关系,相关系数r值为0.751,P值小于0.05。见表1。 　　 　　2.2 拓扑替康诱导MM细胞株凋亡 　　Annexin V-FITC及PI双标记细胞后流式细胞仪检测结果显示,不同浓度TPT(40、80、160、320ng/mL)作用于RPMI8226细胞48h。RPMI8226细胞的早期凋细胞百分数在空白对照组为7.3%,不同浓度药物处理组各值分别与空白对照组相比,P值均小于0.05。表明凋亡细胞随药物浓度和作用时间增加而增加,呈时间-剂量依赖性。同时,也可以见到晚期凋亡细胞(AnnexinV+PI+)也呈