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杂合二倍体马铃薯RH再生体系初步研究 　　摘要：以杂合二倍体马铃薯（Solanum tuberosum）RH89-039-16 （RH）无菌植株为材料，利用控制变量法对植物生长素和细胞分裂素浓度进行筛选以获得再生体系所需激素配比。结果表明，叶片愈伤组织诱导的培养基激素浓度配比为ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；茎段愈伤组织诱导的培养基激素浓度配为比 ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L；愈伤组织分化不定芽的培养基激素浓度配比为ZT 2.0 mg/L+GA3 10 mg/L。 　　关键词：马铃薯（Solanum tuberosum）；愈伤组织；不定芽；分化；再生体系 　　中图分类号：S532 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）02-0493-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.058 　　马铃薯（Solanum tuberosum）为仅次于小麦、玉米的第三大粮食作物，是中国第四大主粮。目前，对马铃薯品种改良的研究主要集中在常规育种和基因工程育种等方面[3，4]。常规育种方法存在人力、物力、财力上消耗大、周期长等问题，自然界优良的种质难以被及时发现利用，因此某种程度上阻碍了现代农业的发展。对马铃薯而言，还存在一些难以逾越的“生物学路障”，如马铃薯遗传分离复杂，后代筛选繁琐。基因工程育种是以分子育种以及分子育种与传统育种相结合的方法来进行作物育种的，这种相结合的方法有着更为突出的优势。随着马铃薯基因组序列的公布，高效遗传转化技术体系和马铃薯EST数据库的建立，为发掘马铃薯功能基因创造了十分有利的条件。在研究基因功能的过程中，首先要了解该基因在植物生长发育及代谢调控过程中所发挥功能与作用，因此在功能基因组的大规模挖掘和鉴定研究中，最重要和最直接研究手段就是创造各种饱和的突变体库。本试验所采用的材料杂合二倍体马铃薯RH89-039-16（RH）的全基因组序列已经由国际马铃薯基因组测序委员会（PGSC）测序完成，并已于2011年7月在《自然》杂志上公布了测序成果[1，2]。 　　目前，最直接且最主要的突变体库创建方法为插入突变体库的构建，是利用农杆菌介导技术将一段外源的DNA元件插入到基因序列中，导致其结构破坏而引起突变，产生带有该DNA序列标签的突变体，利用PCR和测序技术获取插入突变位点序列信息[5，6]。但在利用农杆菌介导技术插入外源基因时，必须构建该材料的再生体系。本试验初步筛选了适宜马铃薯RH的再生体系为后续将目标片段转入马铃薯基因组，研究其基因功能打下了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 受试材料 采用生长15～20 d的马铃薯材料为杂合二倍体马铃薯RH89-039-16（RH）无菌试管苗。在MS基础培养基中进行扩繁，培养温度为（25±2）℃，光照14 h/d，采用日光灯补光。 　　1.1.2 试剂 所用植物生长调节剂IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT、GA3以及试验用试剂为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。 　　1.2 方法 　　以前人的研究作为参考[7-15]，利用控制变量法对植物生长调节剂浓度进行筛选。结合预试验结果，选用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生长素ZT之间的配比来诱导愈伤组织；选用ZT、6-BA和GA3之间的配比来诱导愈伤组织不定芽分化。 　　1.2.1 RH茎段、叶片愈伤组织的诱导 选取在普通MS培养基中培养20 d左右的马铃薯RH无菌苗作为材料，将茎段切去生长点，每段约1 cm。将长势良好的叶片分为3段，分别放入含有植物生长调节剂的MS培养基中培养20 d，筛选愈伤组织诱导培养基。 　　1.2.2 RH愈伤组织不定芽的分化 将得到的鲜绿色较为紧实的愈伤组织转入诱导分化不定芽的筛选培养基中，选用不同的ZT和6-BA以及ZT和GA3的配比，将愈伤组织培养20 d左右，观察记录不定芽发生率。 　　2 结果与分析 　　2.1 RH茎段、叶片愈伤组织诱导培养基的选择 　　在对马铃薯RH愈伤组织诱导培养基进行筛选时，利用6-BA和KT和植物生长素进行激素配比时，无法得到愈伤组织。本试验采用ZT和IAA、ZT和NAA、ZT和2，4-D的不同配比，分别对马铃薯茎段和叶片进行愈伤发生研究。从表1～表3可知，分别利用细胞分裂素6-BA、KT和植物生长素的各种配比不利于杂合二倍体马铃薯RH愈伤组织的发生，而在利用更高效的ZT作为细胞分裂素时有很好的诱导作用。当ZT浓度过低时，并不利于愈伤组织的形成，只有ZT和植物生长素配比较为接近时，才会产生较好的愈伤组织，尤其是ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L、ZT 1.0 mg/L+N