松针提取物α―蒎烯对肝癌HepG2细胞miR―221及其下游靶基因表达影响.docVIP

松针提取物α―蒎烯对肝癌HepG2细胞miR―221及其下游靶基因表达影响 　　[摘要]为探讨松针提取物α-蒎烯的抗肝癌作用及机制，该实验首先使用流式细胞技术检测α-蒎烯对HepG2细胞周期的影响，然后选取与G2/M期调控相关的miR-221，采用荧光定量PCR技术检测α-蒎烯干预对其表达的影响，同时通过TargetScan等在线生物信息学软件分析miR-221的靶基因，最后对相关靶基因的表达用定量PCR进行检测。结果显示，α-蒎烯呈剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖，可阻滞?胞于G2/M期（P2/M期从而发挥抗肝癌作用，其对G2/M期的调控可能与下调miR-221表达和上调其靶基因CDKN1B/P27和CDKN1C/P57的表达有关。 　　[关键词]α-蒎烯； G2/M期； miR-221 　　[Abstract]To investigate the anti-hepatoma mechanism ofα-pinene， HepG2 cell was treated withα-pinene and the change of cell cycle was examined by flow cytometry. The expression of miR-221， which was related the regulation of G2/M phase， was detected by quantitative Real-time PCR. Meanwhile， TargetScan and other online bioinformatics methods were used to analyze and predict the target genes of miR-221， then the expression level of related target genes were detected by quantitative Real-time PCR. The results showed thatα-pinene inhibited the proliferation of HepG2 cells in dose-dependent manner. It was also proved that HepG2 cells were arrested at G2/M phase byα-pinene （P2/M phase， which may be associated with the down-regulate of the miR-221 expression and up-regulate of the CDKN1B/P27 and CDKN1C/P57 expression. 　　[Key words]α-pinene； G2/M phase； miR-221 　　doi：10.4268/cjcm 　　肝癌是影响人类健康的重大疾病，其治疗一直是研究关注的焦点和难点。中医认为肿瘤本质是恶毒，常用具有活血、解毒功效的药物防治肿瘤[1]。松针（pine needle）为松科松属植物的叶，在《本草纲目》中记载其“无毒，入肝、肾诸经，治各脏肿毒，强健肝、肾”，笔者据此推测其可能对肝癌具有治疗作用，并在前期实验中证实该假说[2]。本课题组进一步从松针中分离得到了松针主要成分α-蒎烯，并证实α-蒎烯在体内具有一定的抗肝癌作用，可能是松针抗肝癌的主要活性成分[3]。α-蒎烯属于双环单萜类化合物，具有碳碳双键和碳环结构，丰富的化学结构使α-蒎烯能发生异构化、氧化、氢化、加成、酯???、聚合等一系列化学反应，深入研究α-蒎烯抗肝癌的作用机制是其开发利用的关键，因此本实验采用体外细胞实验来观察α-蒎烯对人肝癌HepG2细胞细胞周期的影响，并根据结果利用定量PCR和生物信息学等方法，从分子水平进一步研究了α-蒎烯对G2/M期相关miR-221及其下游靶基因表达的影响，为进一步阐明α-蒎烯抗肝癌机制提供研究基础。 　　1 材料 　　AvantiTM J25 低速离心机（美国Beckman公司）；MCO-175 CO2孵箱（日本SANYO公司）； MS 800显微镜（日本Olympus公司）；MJ Mini PCR 仪（美国Bio-Rad公司）；CFX96TM实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；ELx800酶标仪（美国BioTek公司）；BD Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）。 　　胎牛血清，DMEM培养基，胰酶（美国Hyclone公司）；碘化丙啶（美国Amresco公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，美国Sigma 公司）；Trizol试剂（美国Life Techn