毛尖茶叶中脂氧合酶活性测定方法建立.docVIP

毛尖茶叶中脂氧合酶活性测定方法建立 　　摘要：采用紫外分光光度法，以亚油酸钠为反应底物，研究毛尖茶叶中的脂氧合酶（LOX）的酶活性测定方法。结果表明，毛尖茶叶中的脂氧合酶的最适pH值为6.3，最适温度为50 ℃，在底物300 μL时酶活性最好，且有较好的热稳定性，60 ℃保温1 h后仍具有一定活性。 　　关键词：毛尖茶叶；脂氧合酶（LOX）；活性 　　中图分类号： S571.101 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0331-03 　　都匀毛尖别称“白毛尖”“细毛尖”“鱼钩茶”“雀舌茶”，是中国十大名茶之一，产于贵州省都匀市，都均市属贵州省黔南州布依族苗族自治区。都匀毛尖主要产于牛场、白芒、团山一带，这里山谷起伏，峡谷溪流，冬无严寒，夏无酷暑，四季怡人，年均气温16 ℃，年均降水量1 400 mm。加上土层深厚，泥土疏松湿润，土质是酸性或微酸性，内含大量铁质和磷酸盐，这些特殊的自然条件不仅适宜茶树的生长，而且也形成了都匀毛尖的独特风格，都匀毛尖因独特的芳香气味而备受青睐[1]。目前分离得到的与茶叶芳香气味有关的物质主要是一些小分子的醇、醛、脂类物质，在茶叶中这些小分子物质主要是由脂氧合酶、脂氢过氧化物裂解酶联合催化产生，其中脂氧合酶是关键酶[2]。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）别称脂肪氧化酶、脂氧酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶（LOX），是一种含非血红素铁的加氧酶，专一催化具有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其相应的脂，通过对其分子加氧，形成具有共轭双键的脂氢过氧化物（hydroperoxides，HPOD）[3]。在茶叶中HPOD进一步被脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）催化，从而生成各种挥发性的脂类物质，即茶叶芳香味的来源。因此，研究茶叶中脂氧合酶的活性，以及建立一个简便、准确、重现性好的LOX活性测定体系可为茶叶芳香气味形成生理的基础研究提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　试验材料茶树鲜叶采自贵州省都匀市白芒；亚油酸（Sigma 公司生产，纯度为99. 9%）；吐温20；麦氏缓冲溶液（pH值为6.3，0.1 mol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）。其他化学试剂均为分析纯，试验用水为实验室自制去离子水。 　　1.2 仪器与设备 　　TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-2C精密pH计，上海理达仪器厂；HH-S型数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；GTR21-1 高速冷冻离心机，上海赵迪生物科技有限公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。 　　1.3 反应底物的制备 　　参照Axelord等的方法[4]，略作修改后具体操作如下：将0.25 mL 吐温20分散于10 mL、pH值为9.0的0.2 mol/L硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入0.27 mL亚油酸，充分混合，再加入1 mol/L氢氧化钠溶液使体系澄清，并调pH值至90，然后用上述缓冲液稀释到500 mL作为底物。 　　1.4 粗酶液（LOX）的提取 　　将鲜茶叶洗净晾干，粉碎，称取10 g加入200 mL pH值为6.3的麦氏缓冲溶液，匀浆2 min，过滤，滤液在4 ℃时高速离心5 min，取上清液，加入固体硫酸铵至30%饱和度，放入冰箱4 h后取出，高速离心5 min后取上清液，加入固体硫酸铵至70%饱和度，在冰箱中过夜，取出高速离心10 min，取沉淀加入15 mL麦氏缓冲溶液溶解，得到粗酶液。 　　1.5 脂氧合酶（LOX）活性的测定 　　参照Axelrod等的方法[4]，略作修改后具体操作如下，取亚油酸钠母液50 μL，缓冲液2 750 μL，粗酶液0.2 mL，配成3 mL 反应体系。在室温25 ℃下反应，测定234 nm处的吸光度（D）。反应1 min时记录1个数据，反应5 min时再记录1个数据，观察2个时间D值的变化。重复3次。酶活性以ΔD234 nm/（g?min）来表示。酶活计算公式： 　　1.6 毛尖茶叶中LOX酶最适pH值的测定 　　在不同的pH值条件（pH值=6.0～7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值=7.5～8.0磷酸盐缓冲液，pH值=8.0～9.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，缓冲液的浓度均为0.1 mol/L）下，在3 mL反应体系中依次加入麦氏缓冲液2 750 μL、亚油酸钠母液50 μL、粗酶液0.2 mL，加入后立即准确计时，反应1 min时测1个吸光度值，待反应5 min后再测1个吸光度值，酶活性同样以ΔD234 nm/（g?min）来表示。重复3次，以LOX活性最大时的酶反应的pH值作为毛尖茶叶