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梭鱼脂肪酸合成酶基因部分片段克隆和表达分析 　　摘要：分离、克隆梭鱼脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，简称FAS）基因的部分cDNA片段（GenBank登录号为KJ848474），共920 bp，编码303个氨基酸，序列分析表明梭鱼FAS基因与其他物种的同源性为74%～95%，其中与军曹鱼、斑马拟丽鱼相似性达95%。FAS基因mRNA在梭鱼鱼皮、肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胃、肠、腹腔脂肪、脑和鳃组织中表达丰度差异显著（P0.05）。 　　关键词：梭鱼；脂肪水平；脂肪酸合成酶；克隆；基因表达分析活性；同源性；系统进化树 　　中图分类号： Q78；Q959.478文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0049-06 　　属鲻形目鲻科梭属鱼类，是温带浅海区重要的经济鱼类之一，具有广盐性、广温性、适应性广、病害少、味道鲜美等诸多优点，目前是江苏沿海正在开发的海淡水养殖新兴品种之一。在目前的养殖中，较易出现腹部肥大的症状：解剖后，可见肠道表面脂肪覆盖明显，肝脏肥大；此种体形与梭鱼本该具有的长流线形身体不符，不受消费者欢迎；有关梭鱼产生上述症状的原因，目前并无研究。鱼类内脏尤其是肝脏脂肪过度聚积，产生脂肪肝或腹部肥大，这些是由于脂代谢紊乱造成脂肪在内脏内的沉积而出现的病理、生理学改变，它的发生、发展跟脂代谢关键因子有重要联系，脂代谢关键因子在这一过程中到底如何作用？是否可以通过营养调控的角度减少或避免此类症状的产生？脂代谢相关的基因众多，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，?称FAS）是脂代谢过程中的关键酶之一。动物体内脂肪的沉积量是脂肪的合成和降解过程动态平衡的结果，其合成和分解过程都是通过一系列酶催化完成的。动物体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的全程合成，即由FAS催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，FAS活性的高低对控制动物体脂沉积具有重要意义[1]。因此，本研究克隆了梭鱼FAS基因的cDNA部分序列，并与其他物种进行同源性比较、系统发生进化树分析组织特异性表达，为进一步研究梭鱼的脂肪代谢机制奠定分子生物学基础。此外，梭鱼的营养需求研究基础薄弱，配合饲料的生产主要借鉴其他杂食性鱼类的营养需要，不合理的营养水平也可能是产生腹部肥大的原因。作为水产动物重要的营养素之一，脂肪是鱼类重要的能源物质，不同的鱼对脂肪的需求不同，饲料中不合理的脂肪水平会导致鱼体腹部累积大量的脂肪[2-3]。因此，本研究针对饲料脂肪水平对FAS基因表达的影响进行初探，从营养和基因表达调控的角度了解梭鱼的脂质代谢，为梭鱼的健康养殖提供理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验设计 　　基因克隆和组织特异性表达用鱼由江苏省响水县一个养殖场提供，鱼体质量约300 g，运回后饲养于体积约 3 000 L 的水泥池（3 m×1 m×1 m）中，用普通商品饲料喂养，适应2周后即挑选10尾健康的梭鱼，用MS-222麻醉，于无菌操作下解剖，取鱼皮、肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胃、肠、腹腔脂肪、脑和鳃11种组织，用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中保存备用。 　　脂肪水平试验用鱼由江苏省射阳县朱平水产苗种有限公司提供，运回后用5%食盐水消毒，然后放入水泥池（3 m×1 m×1 m）中驯养10 d，挑选540尾健康无伤、规格均一的鱼种[均质量（9.5±0.3）g]，随机分为6组，饲养于循环流水养殖桶中（规格：直径80 cm、高度70 cm、体积约300 L），每组设置3个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂6种不同的饲料。6种饲料配制如下：以鱼油为脂肪源，添加水平分别为0、25%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，进口鱼粉、豆粕等为主要蛋白源，制成脂肪含量分别为2.04%、4.83%、7.47%、979%、12.01%、14.59%，蛋白质含量为30.32%的6组等氮等能饲料，配方见已发表文献[4]。正式饲养期间，投饲率为鱼体总质量的3%～5%，每天分3次投喂，投喂时间为 06：30、12：30、18：30，试验期间除投喂外全天充氧，水温控制在（24±2） ℃，养殖60 d。试验结束后饥饿24 h，用MS-222对鱼进行麻醉，每个重复取3尾鱼，无菌操作下取肝脏、肌肉、腹腔脂肪用液氮速冻，然后放入-80 ℃冰箱中保存备用。 　　1.2试剂及仪器 　　Trizol Reagent（Promega）、反转录酶M-MLV、RnaseH、TdT酶、Taq酶、连接酶、SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit试剂盒均购自TaKaRa（大连）；Taq酶、胶回收试剂盒、pUCm-T载体购自上海申能博彩生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由无锡淡水渔业中心农