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海葵目4种海葵线粒体cyt b基因序列分析 　　摘 要:采用CTAB法提取浙江沿海海葵目4种海葵的基因组,PCR获取4种海葵的线粒体cyt b基因的部分序列(1 Kb左右),经序列比对,并利用邻接法(NJ)和最大简约法(MP)进行了系统发育关系的分析.结果发现,红海葵(Actinia equine)、黄侧花海葵(Anthopleura xanthogrammica)及绿疣海葵(Anthopleura midori)3种海葵与已知的海葵科物种老年细指海葵(Metridium senile)的Cyt b基因序列相似性分别均为88%、87.6%和86.9%.NJ法和MP法建立的分子系统树显示,3种海葵与海葵科物种首先聚支,属于同一分类单元.星虫状海葵(Edwardsia sipunculoides)现有分类地位属于爱氏海葵科,但在上述两种分子聚类分析中,均较海葵科物种老年细指海葵更先归入海葵科聚支,其置信度在NJ和MP中分别高达到100%、99%的自引导值.因此,星虫状海葵所在的艾氏属(Edwardsia),归入海葵科较为合理. 　　关 键 词:海葵; cyt b; 系统发育树; 邻接法; 最大简约法 　　中图分类号:Q959.4 文献标志码:A 文章编号:1008-9497(2010)01-087-05 　　 　　刺胞动物门(Cnidaria)虽是低等后生动物(metazoa),但在动物演化上具有重要的意义,特别是随着海洋刺胞动物应用研究的日益深入,越来越受到重视,而种类鉴定又是所有研究中最重要的基础工作.目前刺胞动物一般依据外部形态,以及生活史来进行分类,但仅据形态分类,确实难以反映刺胞动物物种间真实的进化关系.为此,寻找稳定可靠的分子生物学分类依据,以研究刺胞动物的分类及进化规律是一项必要基础工作之一. 　　目前在mtDNA的13个蛋白质编码基因中,细胞色素b基因(Cyt b)的结构是被了解得最为清楚的.其期望分子量为42.7 KD[1],含有大约1 140 bp,只能编码一条含有397个氨基酸的多肽链.基因进化速率适中,其变异程度足以阐明种间的系统发育关系,又有一定保守性,可进行种上阶元水平的研究.因而,Cyt b基因作为最常用的分子标记而被广泛地应用于系统发育分析.据此,笔者将Cyt b基因作为分子标记,对浙江沿海刺胞动物门珊瑚纲(Anthozoa)六放珊瑚亚纲(Hexacorallia)海葵目(Actiniaria)的4种海葵进行了序列扩增和测定,并从GeneBank选取刺胞动物的Cyt b基因序列,以扁形动物门(Platyhelminthes)的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)和亚洲带绦虫(Taenia asiatica)为外类群,以邻接法(Neighbor Joining method,NJ)、最大简约法(Maximum Parsimony method,MP)模型构建系统发育树,分析红海葵(Actinia equine)、绿疣海葵(Anthopleura midori)、黄侧花海葵(Anthopleura xanthogrammica)、星虫状海葵(Edwardsia sipunculoides)等物种之间的关系,以及与珊瑚纲其他物种之间的关系,借以探讨基于Cyt b基因分子标记建立的分类学和传统形态学分类学的关系. 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1 材 料 　　红海葵2006年2月采自象山和宁海,标本采集先用薄荷脑麻醉3~5 h,保存于70%酒精备用;绿疣海葵、黄侧花海葵、星虫状海葵2006年4月采自舟山朱家尖,-20℃保存. 　　1.2 DNA提取 　　样品用ddH2O浸泡24 h以上,直至样品无固定液残余,用滤纸吸干水分.用2×CTAB法提取样本的DNA,用30 μL Milli-Q水充分溶解,-20 ℃下保存备用. 　　1.3 引物设计 　　线粒体Cyt b基因PCR扩增的引物根据GeneBank里已经登录的海葵物种的Cytb 序列设计合成,其引物如下: 　　Cytb_up:5’-GTTCAAACTAGTCGTGCTCAAG-3’ 　　Cytb_dn:5’-AGGGCTCTTCAACAGGCTGACA-3’ 　　Cytb基因组大小约1 140 bp,两条引物可测通,无需设计其它测序引物.上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成. 　　1.4 PCR扩增及电泳检测 　　根据引物特征,设计PCR延伸温度梯度(48.8 ℃、51.7 ℃、54.6 ℃),经温度梯度检验,选取51 ℃为本体系的延伸温度. 　　50 μL PCR扩增体系为:10×PCR反应缓冲液5.0 μL,MgCl2(25 mM#8226;L-1) 2.5 μL,dN