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湖南和福建辣椒上辣椒脉斑驳病毒检测及系统发育分析 　　摘要：辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV），目前在我国仅有在海南黄灯笼辣椒上严重危害的报道。利用湖南省和福建省采集的辣椒样本，检测辣椒ChiVMV的检出率，并克隆ChiVMV的CP基因序列，用邻近法构建了系统进化树，分析其遗传进化情况。结果表明，辣椒的ChiVMV省检出率湖南省为25%，福建省为20%；克隆了湖南省和福建省ChiVMV CP基因各1个，系统发育表明，湖南省和福建的ChiVMV株系与源于韩国ChiVMV株系聚在一个亚簇，而与我国其他地区ChiVMV亲缘关系较远，表明侵染辣椒的ChiVMV在我国进一步扩展，且存在遗传分化趋势。 　　关键词：辣椒脉斑驳病毒；检测；CP基因；系统发育分析 　　中图分类号： S436.418.1+9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0184-02 　　辣椒，一种茄科辣椒属植物，原产于中南美洲热带地区，在全世界都有广泛栽培，是世界上消费量最大的蔬菜之一。我国辣椒种植面积高达140万hm2以上，占据我国所有蔬菜作物种植面积的10%[1]。辣椒病毒病是威胁辣椒安全生产的重要病害，目前能够侵染辣椒的病毒有40多种[2-3]，其中辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）是危害辣椒作物的最主要病毒之一；该病毒于1979年首次在马来半岛的辣椒作物上被发现[4]，随后在世界上许多国家的辣椒作物上陆续被报道[5-7]。ChiVMV主要依靠蚜虫进行非持久性传播[4]，还能通过病株汁液和机械接触等方式传播，不能通过种子传播，因此，其传播扩散速度非常快。 　　在我国，ChiVMV首先在海南省被报道，严重危害海南的黄灯笼椒[8]，随后在陕西、云南等地区相继发生[8-10]。然而，到目前为止，尚未见ChiVMV在湖南以及福建等地区的报道。鉴于ChiVMV对辣椒生产的威胁，本研究检测了湖南和福建等地辣椒上ChiVMV的发生情况，克隆了湖南和福建等地ChiVMV株系的CP基因，并分析了其系统发育关系，以期为明确我国ChiVMV的分布及遗传进化提供科学依据。 　　1材料与方法 　　1.1供试材料 　　辣椒样品：2013年8月，在湖南省和福建省进行辣椒病毒病调查，发现部分地块辣椒病毒病的发病症状与ChiVMV类似，表现为植株矮小，叶片畸形（包括叶片黄化、叶卷曲、叶面枯斑、叶沿皱缩等）。采集湖南省辣椒样本16个、福建省辣椒样本8个。 　　ChiVMV ELISA检测试剂盒购自美国RB公司；cDNA试剂盒、DNTP、氨苄青霉素、EASY Taq DNA聚合酶和DNA回收试剂盒均购自北京全氏金生物技术有限公司，Trizol试剂盒购自Ambion公司，Elisa试剂盒购自RP公司；供试引物由华大基因公司合成，DNA测序测定由生物工程（上海）有限公司完成。 　　1.2ELISA检测 　　ELISA检测具体操作步骤按说明书进行。阳性对照为试剂盒自带ChiVMV病毒初提纯物；阴性对照为温室内健康辣椒苗的研磨液。 　　1.3RT-PCR 　　Trizol法抽提辣椒叶片总RNA，取500 ng总RNA，采用 All-in-one First-Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA。以合成 cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增引物ChiVMV CP特异性引物，CPF（5′-GCGGGAGAGAGTGTTGATGCTG-3′），CPR（5′-TCGCCACTATTGAACAGCTTAAC-3′）；1.0%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物，回收符合预期大小的条带，送生工生物工程（上海）有限公司测序。 　　1.4序列进化分析 　　从Genbank数据库中下载了9个ChiVMV典型分离物的CP基因序列。利用CLUSTAL W对所有CP序列进行多序列联配，利用Mega 5.0采用邻接法，构建ChiVMV CP 基因的系统发育树[11]。 　　2结果与分析 　　2.1ChiVMV ELISA检测 　　ELISA检测结果表明，从湖南采集的16个辣椒样本中，共有4个样本呈现阳性；而从福建采集的8个样本中，检测出2个阳性样本。 　　2.2ChiVMV CP基因克隆与序列分析 　　RT-PCR结果表明，扩增得到大小为1 100 bp的条带（含ChiVMV CP全基因序列以及部分上游基因序列），与预期大小一致。将RT-PCR扩增得到的条带进行序列测定，截取ChiVMV CP基因序列，输入NCBI进行比对，比对结