猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞凋亡和线粒体电位影响.docVIP

猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞凋亡和线粒体电位影响 　　摘要：目的：探讨猫爪草皂苷(Radix rannculus temate saponins，RRTS)对人结肠癌LoVo细胞的增殖和凋亡作用及作用机制。方法：按猫爪草皂苷浓度分为1、10、100、500μg?mL-14个处理组和对照组(未加猫爪草皂苷)，处理LoVo细胞不同时间后，倒置显微镜观察细胞形态；采用MTT法检测细胞增殖的抑制情况；流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率。结果：与对照组比较，猫爪草皂苷处理组可使细胞明显变圆、体积缩小、脱壁细胞增多；MTT法检测显示，猫爪草皂苷处理组随着浓度的增加和作用时间延长，对LoVo细胞的增殖抑制作用增强，并呈时间、剂量依赖性(P0.001)；随着浓度的增加凋亡率增加，药物组与对照组比较差异有显著性(P0.001)；流式细胞仪细胞周期分析图可看出细胞阻滞在G1期，随着给药浓度的增加，细胞凋亡峰(AP峰)越来越明显(图1)；激光共聚焦扫描技术观察显示，细胞经皂苷作用4h、8h、12h后，线粒体膜电位下降(P0.05)。结论：猫爪草皂苷可导致人结肠癌LoVo细胞线粒体膜电位下降，具有明显抑制增殖和诱导凋亡作用。 　　关键词：猫爪草皂苷；结肠癌LoVo细胞；细胞增殖；细胞凋亡；线粒体膜电位 　　中图分类号：11737.25　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2009)05-1079-03 　　 　　猫爪草系毛茛科植物小毛茛(Ranunculus tematusThunb)的块根，性平，味甘、辛，归肝、肺经。有解毒、化痰散结之功能，临床上用于治疗肺结核、颈淋巴结核、咽喉炎、淋巴癌、甲状腺肿瘤及乳腺肿瘤等疾病。王爱武博士发现猫爪草皂苷对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌MCF27细胞的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷给药量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关。早期研究报道，猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn值相反，猫爪草有效成分对肿瘤坏死因子有诱生作用。基于此，本研究观察猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞体外增殖和凋亡的影响，并进一步探讨作用机制。 　　 　　1　材料 　　 　　1.1　细胞　人结肠癌细胞株LoVo购于中南大学湘雅中心实验室。 　　1.2　药物和主要试剂　猫爪草皂苷为河南中医学院第一附属医院中心实验室提供；罗丹明123(Rhodaminel23)荧光探针，Sigma公司。 　　1.3　主要仪器　倒置显微镜，日本Olympus公司；全自动酶标仪，奥地利；流式细胞仪，Coulter，USA；激光共聚焦系统，德国Lcica公司。 　　 　　2　方法 　　 　　2.1　猫爪草皂苷作用的观察①细胞毒性测定(MTT法)用含10％胎牛血清的RPM11640液调细胞浓度为1×104/孔，接种于96孔板，过夜培养，次日实验组加入不同浓度的皂苷，其终浓度分别为1、10、100和500μg?L-1，对照组只加等量的PBS液，每组设6平行孔，将培养板置于5％CO2、37℃培养箱中，继续培养24、48和72h，在额定时间将每孔加入MTF20p,L，继续培养4h，吸去上清液，加入DMSO(150μL/孔)，混匀10rain后，在酶标仪上测定各孔490nm处的吸光度A值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100％。②流式细胞仪(FCM)测定细胞周期和凋亡率不同浓度皂苷处理LoVo细胞，同时设阴性对照组，于24h后PBS洗涤后收集细胞，加入预冷的乙醇(浓度为70％)，于4℃固定24h，离心洗涤后，悬浮于PI染液中，最后以300目筛网过滤，调整细胞浓度为1×106?mL-1，流式细胞仪分析，激发光源为氩离子激光，激发波长488nm，用Mulficycle DNA分析软件行细胞周期的测定。 　　2.2　激光共聚焦扫描技术观察线粒体膜电位的变化细胞的处理：取对数生长期LoVo细胞，经消化、吹散、重悬于10％小牛血清RPMll640培养液中，调整细胞浓度为5×104％dl?L-1。加入内置盖玻片(多聚赖氨酸浸泡，晾干)的6孔培养板内2.5mL，培养24h后分别在不同时段加入含皂苷(100μg?L-1)小牛血清10％的RPM11640培养液中，于4h、8h、12h等时相点终止培养进行观察，另设不加入皂苷的为对照。罗丹明荧光探针标记：皂苷对细胞作用不同时间后，Rh0123 10μg?mL-1染色，在37℃，5％CO2培养箱温育15min，PBS洗3次。用激光共聚焦观察线粒体膜电位的变化：每组选择不同视野的单个细胞，用激光共聚焦显微镜的图像分析系统(TCS～Tool)分析整个胞内的荧光强度(膜电位变化以荧光强度表示)，统计不同作用时间细胞的荧光值，计算的变化。