胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡反应保护作用.docVIP

胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡反应保护作用 　　[摘要] 目的 观察胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡的保护作用。 方法 建立肾缺血再灌注损伤大鼠模型，将实验大鼠随机分为3组，即假手术组、缺血再灌注组和胡黄连苷Ⅱ组，每组10只。全自动生化分析仪检测大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）浓度，光镜观察病理组织变化，免疫组化检测Caspase-3表达，Real-time PCR及Western blot检测Bax、Bcl-2和PARP-1表达水平。 结果 与假手术组比较，缺血再灌注组Cr、BUN水平均明显增高；光镜病理组织可见肾小管损伤明显；免疫组化示Caspase-3表达增强；Real-time PCR及Western blot检测Bax、PARP-1表达增强，而Bcl-2表达减轻，差异有统计学意义（P 0.05）。胡黄连苷Ⅱ组与缺血再灌注组比较，肾功能指标明显减低，肾小管上皮细胞损伤减轻，Caspase-3表达显著减弱，Bax与PARP-1的活性明显下降；Bcl-2表达显著增强，差异有统计学意义（P 0.05）。 结论 胡黄连苷Ⅱ在肾脏缺血再灌注损伤时能有效地保护肾功能，其作用机制可能与增加Bcl-2表达，降低Bax、PARP-1、Caspase-3等凋亡基因的表达有关。 　　[关键词] 缺血再灌注损伤；胡黄连苷Ⅱ；凋亡 　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（c）-0021-04 　　急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是临床上常见的危重病症，由多种病因导致[1]。AKI因其较高的死亡率而具有重要的临床意义，至今仍然有30%～70%不等[2]。肾脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是导致AKI的重要因素之一，常发生在肾移植、保留肾单位手术、肾动脉狭窄、肾积水、主动脉搭桥手术、体外循环、栓塞性疾病、意外或医源性损伤中等。目前，用于减轻肾IRI的措施主要分为三类：药物干预、外科或机械性干预和基因治疗等，而寻求一种有效、廉价的措施，势必会产生较大的经济和社会效益。胡黄连根提取物含有多种萜类化合物和糖苷[3]，胡黄连苷Ⅱ是提取物的主要活性成分之一。许多研究表明，胡黄连苷Ⅱ有大量的药理作用，包括神经保护、肝脏保护、抗炎、抗凋亡、免疫调节等作用[4-5]，对心、脑和肢体IRI均有保护作用[6-9]。然而，其在肾IRI中的作用研究缺乏，因此笔者欲研究胡黄连苷Ⅱ在肾IRI中的作用及其机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 模型的建立与分组 　　健康雄性SD大鼠30只，8～10周龄，购自武汉大学医学院实验动物中心（合格证号：42009800001176），体重为250～300 g，实验前适应性喂养1周，自由饮水、进食。采用随机数字表法将大鼠分为以下3组：①假手术组（n = 10）：腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg），麻醉大鼠，然后游离双侧肾脏，切除右肾后缝合腹壁；②缺血再灌注组（n = 10）：手术步骤与假手术组相同，但在游离双侧肾脏及切除右肾后，用无创伤血管夹夹闭左肾动、静脉45 min进行缺血，然后开放血管夹进行再灌注24 h（既往文献研究表明再灌注24 h是研究肾脏缺血再灌注急性损伤的最佳时间点），肾脏由暗红变色鲜红色代表再灌注成功。③胡黄连苷Ⅱ组（n = 10）：手术步骤与缺血再灌注组相同，但在缺血45 min后、再灌注之初腹腔注射（关于胡黄连苷Ⅱ对器官缺血再灌注损伤的文献报道均采用的是腹腔注射）Picroside Ⅱ（10 mg/kg），而假手术组和缺血再灌注组注射等量的1 mol/L的PBS。 　　1.2 试剂 　　胡黄连苷Ⅱ购于天津奎青医药公司，TLR4抗体购自Santa Cruz公司，NF-κB抗体购Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。 　　1.3 样本采集和处理 　　1.3.1 标本采集 分别于缺血/再灌注损伤24 h后采集大鼠下腔腹腔静脉血待测，处死各组大鼠获取肾脏组织，一部分迅速置于-80℃中保存，另一部分用固定液固定后，常规石蜡包埋。 　　1.3.2 血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的检测 将采集的大鼠血液标本常温离心3000 r/min，离心10 min后，使用Olympus全自动生化分析仪（Au2700）测定血清Cr和BUN水平。 　　1.3.3 肾组织病理学检查 取大鼠肾组织，用多聚甲醛固定后，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，脱蜡，HE染色，后在200倍光镜下观察其病理改变。 　　1.3.4 免疫组化测定Caspase-3的表达情况 肾组织石蜡切片，厚4 μm，按SP法