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胶体金免疫层析法快速检测李痘病毒研究 　　摘 要：用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白（CP）基因，然后将其连接到原核表达载体pET29（a）上，得到pET29a-PPV重组载体，然后将该载体转化大肠杆菌BL21（DE3）， 经过IPTG诱导PPV CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。回收表达蛋白后免疫家兔，获得PPV特异性抗血清，经过酶联免疫吸附法测定其效价达到3.2×104，然后采用该抗血清制备出专门检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，测试结果表明，该试纸条不仅特异性强、稳定性好，灵敏度也高，可以检测到1？滋g/mL粗提病毒和稀释100倍的病汁液，操作简便，10分钟之内即可出检测结果，特别适宜口岸检疫和田间快速诊断。 　　关键词：李痘病毒；免疫层析；检测 　　李痘病毒（Plum pox virus，PPV）为核果类果树危险性最大的病毒之一，是我国的进出境检疫性病毒，别名有莎卡（Sharka）病毒、李树病毒7（Prunus virus 7）、李树痘病毒（Sarka virus）等，属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中的马铃薯Y病毒属（Potyvirus），其主要自然寄主是李属的木本植物，如杏（Prunus armeniaca L.）、桃（P. persica L.）和欧洲李（P.domestica L.）、日本李（P.salicina Lindl.）以及甜樱桃（P. avium L.）和酸樱桃（P. cerasus L.）等，传播介体为蚜虫作非持久性传播，长距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运[1]。 　　目前对该病毒的检测方法主要采用分子生物学检测方法[2，3]，但是此类检测方法虽然灵敏但操作步骤比较繁琐、速度慢、通量低，不适合口岸现场的大批量样品的快检快放的通关要求。而胶体金免疫检测试纸条检测方法目前已经广泛使用于生物检测的众多领域，是一种行之有效的现场快速筛查检测方法，本课题就是根据免疫学的理论和前人研究的结果，对检测李痘病毒的胶体金免疫层析试纸条进行了初步的探索研制，以便满足我国一线口岸对该病毒快速检测的需求。 　　1 研究材料 　　李痘病毒材料由国家植物病毒检疫重点实验室（中山）提供，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。柠檬酸三钠、硝酸纤维素膜（NC膜）、氯金酸及各类生物酶类等均购自广州普博生物技术公司；羊抗兔抗体、碱性磷酸酶标记抗体购自军事医学科学院， 抗体纯化柱和Ni-NTA购自Invitrogen公司；原核表达载体和大肠杆菌菌株DH5和BL21（DE3）以及BIOTEK酶联检测仪、日本梯度PCR仪、三维喷点平台（XYZ3050）、微定量喷头（BJQ3000XY）、以及切展机（6008-A007）等设备均由本重点[1]实验室提供。 　　2 研究方法 　　2.1 病毒样品的鉴定及保存 　　病毒种类的确证：主要采用血清学（ELISA）结合分子生物学检测方法进行确证。 　　毒种保存：主要采用二种方法：一是将感病植物叶片保存于-80℃冰箱中；二是将提纯的病毒冷藏于-80℃冰箱中。 　　2.2 李痘病毒的ELISA检测方法 　　采用间接血清学检测方法进行。 　　2.3 李痘病毒总核酸的提取 　　采用Trizol试剂提取该病毒的总RNA，并将提取的总，RNA在-80℃下储存备用。 　　2.4 目的基因的RT-PCR 扩增 　　（1）设计扩增该病毒外壳蛋白基因的引物 　　根据李痘病毒外壳蛋白基因的保守序列，上游引物为PPV-F1：5-CA GGATCC GCTGACGAAAGAGAAGAC-3’，下游引物为PPV-R1：5- TG AAGCTT CACTCCCCTCACACCGAG-3’，由大连宝生物公司合成。 　　（2）RT-PCR条件 　　直接采用一步法试剂盒PrimeScriptTM One-Step Ver.2.0（大连宝生物公司试剂盒产品）进行RT-PCR扩增，之后取5μL扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检查RT-PCR结果。 　　RT-PCR反应条件：先50℃ 30min进行反转录，然后94℃ 3min变性，之后再94℃ 1min、58℃ 30s、72℃ 1min，循环35次，最后72℃延伸10min。 　　2.5外壳蛋白基因的克隆和序列验证 　　（1）PCR产物的回收：参照试剂盒说明进行。 　　（2）重组质粒的构建：采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒。 　　（3）感受态细胞制备：感受态大肠杆菌的制备参考Sambrook等（1989）的氯化钙法。 　　（4）重组质粒的转化及筛选：参考Sambrook等（1989）的氯化钙法。 　　（5）重组质粒的鉴定：主要采用酶切、PCR和测定序列三种方法结合起来进行确定。 　　2.6 构建李痘